2022年1月26日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所徐健研究团队联合中国海洋大学王师教授团队在Genome Biology发表了题为 Species-resolved sequencing of low-biomass or degraded microbiomes using 2bRAD-M 的研究论文，发布了一种新的名为2bRAD-M的微生物组测序方法(图1)。
图1. 2bRAD-M方法工作流程
在当前微生物组研究中，解析微生物群落的物种构成主要依赖于两种高通量研究技术：扩增子测序（16S/18S/ITS）和鸟枪宏基因组测序（WMS）。然而目前主流的两种技术手段都存在一定的瓶颈问题：比如，扩增子测序存在扩增偏好性、脱靶扩增、分辨率低等问题，且无法同时检测细菌、真菌、古菌。虽然鸟枪宏基因组测序可以有效避免上述问题，但该方法对样本DNA质量要求高，面对大规模临床样本容易受到成本限制，且不适合于检测含有大量宿主DNA的样本，如石蜡切片、肿瘤切片、肿瘤组织等样品检测。因此，亟待开发一种高分辨率、高准确性、高敏感性，并且可以同时对多种微生物进行鉴定的低成本微生物组测序技术。
IIB型限制性内切酶，酶切双链DNA后形成等长短片段（20-33 bp）， 2bRAD是一种基于IIB型限制性内切酶的测序技术，具有敏感性高、可重复性强的特点，有望被应用于解决宏基因组测序瓶颈问题的简化基因组测序技术。但将简化基因组测序引入宏基因组测序仍需要高复杂度的算法开发和系统性的评估。青岛能源所孙政博士和黄适博士深度挖掘简化基因组测序技术2bRAD用于宏基因组测序的潜力和局限性，建立了新一代简化宏基因组测序技术2bRAD-M，该方法不仅能够有效处理低起始量样本，且对于高宿主污染和高降解度的微生物样本可获得高精确度的细菌、古菌和真菌的种水平定性及定量结果。
该研究首先利用2bRAD技术处理菌群总DNA样本，对IIB酶切片段进行扩增和测序，然后通过以微生物基因组IIB理论酶切位点为参考基因的算法流程来推断菌群结构。为了验证2bRAD用于宏基因组测序的可行性，该研究首先通过模拟酶切数据，研究了不同来源、相似度或复杂程度以及不同实验方法学对菌群定性和定量分析的影响，并解决了高重复性短片段DNA干扰序列匹配的问题。然后通过人工和自然菌群样本，进一步验证了2bRAD在宏基因组测序方面的性能（如敏感性、重复性、分辨率、准确度和偏好性等），深度挖掘了2bRAD用于宏基因组测序的潜力和局限性，并最终建立了2bRAD-M简化宏基因组测序技术。
由于2bRAD-M技术仅使用了具有代表性的1%左右基因组信息，因此，该技术能够低成本有效处理低生物量和降解样本。通过对人工合成菌群的测序发现，2bRAD-M能够应对总DNA仅为1 pg，高度片段化（长度仅有50 bp），以及99%宿主DNA污染的微生物样本，并产生高精确度的细菌、古菌和真菌的种水平定性和定量结果。在应用方面，该研究系统性的展示了2bRAD-M在粪便，皮肤，环境等样本中的准确性以及应用潜力。除此之外，研究发现仅用极少量的宫颈癌FFPE切片样本（3 cm × 2 μm）就可以帮助捕捉到一些潜在的癌症微生物标志物。目前，研究人员正在探索更多适合2bRAD-M的宏基因组测序场景。
本项研究的第一作者为中科院青能所孙政博士（现为哈佛医学院博后）和黄适博士（现为香港大学长聘教轨助理教授），该工作由中科院青能所单细胞中心徐健研究员、中国海洋大学王师教授主持完成。
原文链接：
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02576-9
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