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论文题目：Single-cell approaches in human microbiome research
期刊：Cell
IF：66.850
发表时间：2022
摘要
微生物培养和宏组学分析技术极大地促进了我们对人类微生物组的分类和功能变异及其对宿主影响的理解，下一个跨越式的科学进步是了解低丰度和低流行性细菌的作用，以及研究构成微生物生态系统复杂性基础的单个细胞行为，因此，单细胞技术正在迅速发展，从而分离、培养和表征复杂群落中单个微生物的基因组和转录组。
本文中，作者讨论了单细胞技术如何帮助我们更好的理解人类微生物组的生物学和行为。
引言
多年来，人类微生物组领域通过技术创新不断发展，在研究的复杂性、规模和分辨率方面逐渐提高，同时区分了宿主相关微生物组的结构、多样性和功能。
在过去几十年中，培养方法的改进已使我们获得了数千种人类相关菌株，它们被用于基因组和代谢表征，以及微生物和微生物-宿主相互作用的体外机理研究。
同时，不依赖培养的的扩增子或宏基因组测序方法也已证明其有能力阐明微生物组变异及其与宿主生理和健康的联系，在宏基因组学快速流行的过程中，其他“宏组学”技术，如宏转录组学、宏蛋白质组学或宏代谢组学，也已被广泛用于阐明人类微生物组的功能。
虽然这些技术已成为当代人类微生物组研究的标准，但它们也同样具有不可避免的应用限制和挑战。
例如，低丰度分类群很难在实验室条件下分离或培养，它们的基因组在宏基因组样本中的代表性不足，据估计，在经过大量研究的人类肠道微生物组中，超过70%的细菌仍然缺乏代表性的培养菌株。
此外，“组学”技术无法区分和验证单个微生物的功能。即使在单个菌株内，微生物个体细胞也可能具有高度异质性，使得细菌克隆种群的基因表达同样表现出显著的异质性。这对于菌株在特定条件下的存活至关重要，例如，在抗生素治疗期间的细菌持久性。
对于这类微观多样性的研究，“宏组学”方法存在明显不足，为了克服这些挑战，进一步的创新越来越多地集中在单细胞水平。事实上，在当今微生物组研究工作流程的每一步，都引入了单细胞分析，并不断进行微调，以解决新的生物学问题。
在这篇综述中，作者介绍了最先进的单细胞分离、培养、基因组和转录组分析方法，这些方法有助于微生物组研究的进一步发展。虽然作者主要关注关于人类微生物组的研究，但也承认单细胞测序在其他领域的工作，如动物或环境微生物组，特别是在方法开发方面。最后，作者还强调了需要克服的人类微生物组样本的具体挑战，以促进该领域的单细胞技术的发展。
细菌分离、培养和筛选中的单细胞方法
与传统方法（如琼脂稀释平板法）相比，单细胞技术在分类广度和通量方面彻底改变了微生物组分离过程。
将样本的微生物群落物理分解为空间分离的细胞，克服了微生物分离中的一个主要问题，即个体生长速率的差异以及营养和空间竞争不可避免地促进快速生长的生物体的过度生长。因此，单细胞方法有可能恢复更高的物种丰富度，而传统方法通常只能得到主要的或快速生长的物种。
但是，由于一些细菌细胞在与其共生（例如交叉喂养）物种分离时可能无法生长，因此仍建议在单细胞方法的基础上结合传统的群落培养技术。
人类微生物组单细胞分离和培养的最新技术创新采取了两种主要方法之一：
（1）通过基于液滴的微流体将水相中的游离细胞封装在单或双水-油乳液中；
（2）在物理微孔或微阀的小型阵列中对单个细胞进行基于有限空间的分区。
液滴微流体
基于液滴的微流体依靠两相微通道流体捕捉单分散球形颗粒中的单个细胞或分子，这些颗粒由生物相容性油包裹，由于其在通量、并行化、标准化和动态过程控制方面的潜力，该技术被视为单细胞微生物组分离和培养工作流的关键组成部分。
鉴于大多数被动细胞捕获过程由泊松统计决定，在空微滴和包含两个或多个细胞的液滴的背景种群中，只有一部分生成的微滴可以有效地包含单个细胞。
通常通过优化注入样本的稀释度来实现最大化的单细胞封装率，而更先进的技术，如实时成像，可以通过机器学习算法用于单细胞液滴的选择性分选。
在人体的厌氧生态系统，例如肠道、阴道或龈下缝隙微生物组中，应用液滴微流体技术分离、培养和分析单个微生物细胞有一些额外的困难，即样品处理、生长监测和液滴分选需要在无氧条件下进行。
由于与流式细胞仪或分选装置耦合的液滴发生器的微流控管道难以集成到标准厌氧工作站中，研究人员开发了一些厌氧条件生长监测的替代方法。例如，微流控条纹板（MSP）技术基本上将微流控与标准板条纹原理相结合，使微通道限制的纳升液滴由均匀的油塞隔开。
MicDrop平台提供了解决该问题的另一种方法，其将厌氧封装和培养的单个细菌细胞微流控液与Illumina MiniSeq测序相结合，从而实现间接非连续生长监测。Michdrop的概念是建立在这样一个假设之上的，即产生的16S rDNA序列变体（SV）可以作为包含相同细菌分类群的液滴之间共享的条形码。这样，通过结合16S rDNA测序和qPCR数据在SV水平拟合生长曲线，可以在厌氧工作流之外跟踪单个物种的生长。MicDrop平台的高培养通量允许用户进行功能性筛选，评估在选择性培养基条件下非微生物富集的人类微生物组亚群中的生长动力学、分类学特性和单细胞液滴的丰度。
与MSP系统相比，MicDrop平台侧重于培养和分析，但由于纵向液滴采样的破坏性，其主要设计目的并非用于获得细菌培养株。为此，Watterson等人开发了一种基于液滴的微流控工作流，并且集成了微观检测，将分离、培养和分选三种基本功能结合在一起，通过定义类似光密度的阈值标准，可以单个细胞形成的细菌菌落进行选择性地偏转、收集和传代，从而进一步进行分类学和功能表征。
虽然厌氧培养对于肠道或阴道细菌至关重要，但对于其他人类微生物生态系统，如口腔表面区域和人类微生物组相关的宏基因组克隆库，这一点不那么重要，有氧工作条件还可以实现更复杂和空间要求更高的微滴设置，用于深入的功能筛选目的。这方面的主要发展之一是将生物相容性微流控双水包油乳化液滴技术（MDE）和荧光激活细胞分选（FACS）相结合，以研究荧光标记靶菌株和潜在效应菌株之间单细胞水平的微生物相互作用。
高通量筛选技术同样也可以整合进功能宏基因组的克隆文库中，例如，使用商用荧光糖苷类似物，Tauzin等人通过液滴微流控技术筛选了20000个fosmid大肠杆菌克隆的文库，该文库覆盖了来自人类回肠粘膜样本的0.7 Gb宏基因组DNA，随后对选定克隆进行深度测序和功能分析，可以识别有助于人体神经节苷脂和乳寡糖降解的途径，证明单细胞微流体在功能性宏基因组学项目中的应用前景。
微列阵或基于分区的技术
与液滴微流体相比，基于分区的工作流的主要优点是提供了更大的培养空间，可以将单个细胞扩展到更大体积的高密度微菌落。这不仅可以减少分拣时无法生长的菌株的损失，还可以延长培养时间并提高生物读数的敏感性，此外，与液滴相比，从离散的分区中采集选定的微菌落通常更加直接。
虽然许多早期的微分区设备，如微皮氏培养皿、iChip和SlipChip可以在厌氧工作站中轻松操作，但很少有研究在人类相关厌氧细菌上对这些技术的适用性进行验证。
近年来，单细胞工作流程从自制实验室设备发展到更易于使用的商用台式设备，在这一领域，Prospector系统是一个基于阵列的自动化分区培养平台，它将光学生长监测、选择和微培养转移集成在一个适合中型厌氧机柜的仪器中。在一项初步研究中，基于配对16S rDNA宏基因组数据的分析，研究人员使用该系统从六个人类粪便样本中分离出的45个物种中约有一半被认为是低丰度（0.2%）分类群，表明这种微阵列技术也有可能用于发现肠道微生物组中较罕见的成员。
与大多数小型化分区工作流程一样，Prospector系统纯培养回收的实际通量也远低于系统的固有捕获能力，因为无法确保每个单独的培养体积（孔或液滴）加载单个细胞，也无法保证加载时细胞还处于存活状态。
除了需要分离和生长单个细胞外，另一项挑战是捕捉单个细胞在传代过程中的进化，这将揭示有关其生长、生理动力学和对非生物参数反应的基本信息。解决这一挑战方法是单细胞分析后的timelapse成像（SIFT），这是一种旨在通过多代延时显微镜跟踪空间受限活细胞的工作流程。
在两层SIFT微流控芯片中，细胞在第一个流动层中分离，而第二层集成了一系列微流控阀门、流动通道和用于单个细胞芯片外收集的光学陷阱。虽然到目前为止，仅在细菌文库中证明了使用SIFT对单个细菌进行无损多代成像和跟踪，然后对感兴趣的细胞进行下游分离和扩大培养，但该技术也可能应用于高通量分离和筛选（厌氧）人类微生物组。
人类微生物组中的单细胞基因组分析
复杂微生物组样本基因组分析的单细胞技术可以进一步深入了解其系统发育、生态学和进化，这些技术不仅能够扩展和改进已测序的人类微生物目录，还可以解决单细胞水平上的微生物相互作用，并绘制单个细菌在其自然生态系统中的空间定位图。
单细胞基因组测序扩展微生物目录
在宏基因组测序被广泛应用之前，就出现了从单个微生物细胞获得单扩增基因组（SAG）的方法，这些方法主要用于帮助阐明“微生物暗物质”，即迄今为止仅通过基于16S rDNA的调查确定的大部分微生物类群，但其缺乏培养的代表性菌株或高质量的参考基因组。
第一个人类相关的SAG是从口腔分离的候选门TM7（后来更名为Saccharibacteria），在这项工作中，工作人员使用了一种专用的微流控设备，在设备的不同模块中分别进行细菌分离、裂解和基因组扩增。
随着宏基因组学技术和计算组装方法的发展，在过去几年中，从人类微生物组获得的宏基因组组装基因组（MAG）的数量和质量显著增加，即使从宏基因组学中获得的MAG质量不断提高，单细胞基因组测序仍然在扩大微生物目录方面有明显作用，其改进了组装MAG的结果，并提供了单个细胞完整基因组序列的“真实”生物验证。
例如，有几项研究将单细胞基因组测序与宏基因组学相结合，以比较这两种技术或整合它们以获得更好的基因组组装结果。在人类微生物组中，这种双重方法获得了不同人葡萄球菌皮肤菌株的两个基因组的组装，而仅使用宏基因组方法就只能组装到其中一个基因组，这两种菌株的相关质粒不同，这可能表明它们的抗生素耐药谱或毒力因子不同。
单细胞基因组学的优势之一在于其可以针对具有特定代谢能力的特定分类群或罕见的微生物组成员。利用微孔板上单个细胞的流式细胞术分选、基因组扩增和特定16S rDNA基因序列的选择，早期的研究从口腔或肠道中得到了人类相关细菌的SAGs。此外，在分离之前样本中可能会富集特定的细菌，在人类微生物领域，Deltaproteobacteria特异性荧光原位杂交（FISH）探针可以通过FACS从口腔靶向富集单个脱硫球和脱硫弧菌细胞，以进行基因组测序。
基因组扩增方法和测序通量的技术进步也最大限度地提高了非靶向研究中大量单细胞的并行测序能力。例如，这些技术进步已在小鼠肠道微生物组的单细胞基因组测序中得以应用，产生了298个高覆盖率的MAGs。
微滴微流体技术在提高微生物单细胞基因组测序的通量方面发挥了进一步的作用。单细胞基因组测序（SiC-seq）是第一种基于液滴的方法，被用于表征海洋微生物样本，在该方法中，单个细胞封装在熔融的琼脂糖微滴中，聚合后提供半渗透基质固定细菌细胞，然后在微流体设备中处理这些微凝胶，以生成用于测序的单细胞基因组文库。
后来，研究人员通过在微孔板中分选琼脂糖液滴，简化了该方法，从而减少了微流控处理步骤，这种改进的方法被称为SAG-gel，并被用于研究小鼠的肠道微生物组的研究，从两个独立样本中获得了346个SAGs。
最近的研究使用琼脂糖微凝胶的替代品作为基质来捕获单个细胞，该技术成为Microbe-Seq，其将单个细菌封装在含有裂解试剂的油包水中，然后，液滴在微流控装置中与其他试剂进行一系列合并步骤，以执行基因组扩增，Microbe-Seq已用于分析人类粪便样本，每个样本能够产生数千个SAGs。
另一种方法是基于微胶囊的生成，其中半透性水凝胶外壳包含一个水核，内部是是分离出单个细菌细胞，只需清洗微胶囊并交换缓冲液，即可处理这些微胶囊，无需在微孔板中进行分拣，也无需使用复杂的微流控设备，一项研究通过15个人类肠道微生物菌株建立的模拟群落验证了该方法。
尽管全基因组扩增的方法已经有了长足的进步，但SAG的一个常见问题就是它们往往高度碎片化和不完整，如果有足够完整的DNA可用，将long-read技术纳入SAG的生成过程可能有助于解决这些问题。最近，一项使用NanoPore测序的研究表明，通过使用微流控设备执行全基因组扩增和文库制备步骤，可以将起始DNA的数量减少到单个细菌细胞的数量，这项工作为进一步探索将long-read技术纳入单细胞微生物基因组测序指明的方向。
单细胞水平的微生物基因组图谱分析人类微生物生态学和进化
单细胞微生物基因组测序还可以深入了解人类微生物组的生态学和进化，例如可移动基因单元的传播。Brito及其同事在180个单细胞粪便细菌基因组中鉴定到了20000多个可移动基因，其中的大部分在多个人类群体的个体中均有检出，饮食这些移动基因的丰度有很大影响。
单细胞基因组学也被用于研究噬菌体与宿主的相互作用，有一种结合单细胞基因组测序的“病毒标记”靶向策略可以发现肠道物种中的病毒-宿主的配对关系。病毒标记包括向潜在宿主细菌中添加荧光标记的病毒颗粒，然后通过FACS富集特定宿主细胞，这种方法发现了363个独特的宿主噬菌体配对。此外，通过交换不同个体的细菌和病毒组分，研究人员确定了受试者之间的大量噬菌体-宿主交叉反应，这表明对于大多数病毒，宿主特异性是在物种水平而不是菌株水平。
最近，单细胞基因组方法有了新的发展，在空间基因组学领域，以高分辨率绘制人类相关生态系统的微生物生物地理图谱是一个新兴的重点方向。基于FISH的方法现在可以在单细胞水平上进行原位微生物鉴定，早期方法包括使用16S探针的组合标记和光谱成像FISH（CLASI-FISH），该技术通过组合探针检测15个常见的口腔属，探索了牙菌斑中单个的跨属物理联系。
通过这种组合标记概念的进一步探索，开发了基于FISH进行的高系统发育分辨率微生物组映射（HiPR FISH）技术，其通过16S标记，在一个步骤中仅使用10个不同的荧光团，鉴别出多达1023个不同的分类群。HiPR-FISH显示了抗生素对小鼠肠道细菌空间网络的破坏，并确定了牙菌斑中的空间多物种联合体。
这种技术还有一些限制，一方面是基于16S的测序对于细菌的分类学分辨率有一定限制，另一方面FISH是基于特定分类学设计探针，因此只能分析已知的细菌分类群。
单细胞转录组分析功能异质性
上述技术提高了我们对人类微生物组成员进行识别和基因组分类的能力，但是众所周知，同一类细菌种群之间也具有显著的功能异质性，因此需要其他方法来实现宿主相关微生物的全功能表征。单细胞转录组学的出现极大地提高了我们描述真核细胞群体中这种异质性的机制和模式的能力，十年来这些方法的快速进化终于开始得到利用，揭示了原核生物中基因表达的个体模式。
单细胞RNA-seq分析固有的功能异质性
原位组合索引技术的发展解决了需要在微液滴水平单独划分细菌的一些技术挑战，具体而言，在细胞裂解之前将分子条形码添加到cDNA的能力消除了在液滴或孔中进行物理分隔的需要，这一技术通过细胞本身充当单独的隔间，促进了样品的多步骤处理，因此，可以将含有唯一条形码转录本的细胞合并并批量裂解。
最近，两种技术被应用于单细胞转录组分析，分别为PETRI-seq和Micro-SPLiT，基于现有的SPLiT-seq过程，该方法能够全面分析成千上万个细胞的基因表达，并识别罕见或新的亚群。应用于金黄色葡萄球菌的PETRI-seq揭示了经历原噬菌体诱导的罕见细胞亚群，另一方面，Micro-SPLiT成功创建了枯草芽孢杆菌细胞在不同生长阶段的代谢和生活方式变化图谱，还发现了新的和意外的基因表达状态，包括显示罕见应激反应机制诱导能力的细胞亚群，这种反应可以通过将外源DNA整合到基因组中来帮助这部分细胞更快地进化。
这两种技术在方法学上的差异很小，因此还无法预知那种技术更为优秀，两者一个显著的区别是，PETRI-seq分别在革兰氏阳性和革兰氏阴性分离株上进行测试，在每种情况下使用不同的酶，而Micro-SPLiT是在在混合细菌群上进行测试，但是其可能具有对革兰氏阴性细胞的mRNA捕获的偏好。因此，这两种技术可能需要进一步优化，以便在复杂微生物组样本中具有更广泛的适用性。
虽然这种组合条形码策略消除了单细胞分离的需要，但利用现有商业平台的能力，用于真核细胞的液滴分离和scRNA序列也被证明是可能的。10X Genomics公司的Chromium系统是一个广泛使用的平台，包括商用试剂盒和台式微流体技术，每次运行能够对多达10000个单个真核细胞进行scRNA序列分析。在应用于酵母细胞后，该平台使用与特定靶细菌基因组内所有蛋白质编码序列互补的大型寡核苷酸探针库，最近已可以应用于细菌细胞的scRNA序列。改平台的探针包括一个30poly（a）尾，可以使用10X铬技术捕获原核mRNA，应用于纯培养大肠杆菌和枯草芽孢杆菌样本，该方法识别了多个细胞亚群，包括以前未知的具有不同代谢、趋化性和运动表达谱的细胞亚群，值得注意的是精氨酸生物合成基因在不同亚群中的差异表达，表明化学不相容代谢过程的潜在空间分离。
但是目前这些技术还无法得到空间水平上的基因表达图谱，此外，重要的是要注意，当将这些方法应用于复杂的人类微生物组样本时，依赖基因组特异性探针是一个重要的限制，因为在单个实验中可能检测到的分类群数量可能受到可设计的探针集数量的限制，此外，该技术目前只能用于具有具有序列和注释的基因组良好特征的分类群。
基于FISH的方法解决细菌细胞种群的空间功能异质性
尽管科研人员努力在单细胞水平绘制分类学生物地理学图谱，但目前缺乏对微生物组中基因表达空间异质性的有效粪便，虽然结合FISH技术的传统显微镜工作能够以单细胞分辨率记录基因表达的空间异质性，但它仅限于少量靶基因，近期，与scRNA-seq类似，组合索引的进展最近也扩展到了基于FISH的技术，将潜在基因靶点的数量增加到了成百上千个。
当前基于seqFISH的方法涉及两个杂交步骤，首先，特异性mRNA序列由初级非荧光探针杂交，探针两侧为短基因特异性序列，然后，可以通过针对主要探针的荧光标记读出探针的二次杂交来检测转录本。读出探针可以快速剥离，新探针在连续几轮中杂交，最近，该技术已通过并行顺序FISH（ParseqFISH）方法适应用于细菌。
ParseqFISH被应用于临床上重要的病原体铜绿假单胞菌，并能够在许多代谢和毒力相关的转录状态中识别和分辨空间水平的异质性，ParseqFISH还能够识别生物膜中不同的生理状态，在微米尺度上解析这种异质性。这种方法在阐明共生微环境中的异质性方面具有很大的潜力，空间方法有助于分析肿瘤微环境中特定细菌细胞的表达，有助于了解细菌与宿主的相互作用，对治疗具有潜在意义。
Dual scRNA-seq揭示宿主-微生物互作机制
Dual scRNA-seq技术利用现有的真核生物方法捕获和测序细菌暴露宿主细胞中宿主和微生物的mRNA，在揭示宿主-微生物相互作用方面显示出巨大的潜力。
在单细胞Dual测序（scDual-seq）中，Avital及其同事用随机六聚体取代了基于polyA的引物，以捕获宿主和细菌mRNA，这是第一种在单细胞规模上同时对宿主和细菌RNA进行测序的方法。随后的处理和测序是通过现有基于真核生物的scRNA-seq技术的改进版本实现的，由此产生的reads可以映射到宿主和细菌基因组。
该技术在体外对暴露于沙门氏菌的小鼠巨噬细胞进行了初步测试，可以区分巨噬细胞的三个亚群，并表征通过它们的线性细胞进程，重要的是，该技术还鉴定了两个沙门氏菌亚群，显示了与特定巨噬细胞亚群密切相关的转录异质性的清晰模式。虽然这种方法在这种特定的体系中很有前景，但由于细菌生理学的差异，这种方法捕获细菌mRNA的能力有限，每个宿主细胞需要有超过10个互作的细菌细胞才能达到细菌转录组的测序要求。
为了解决Dual scRNA-seq的固有局限性，一些方法通过增加特定步骤来富集微生物mRNA。例如，PatH-Cap方法可以捕获每个基因更多的细菌转录本，富集前后的样品测序可以分别实现宿主和病原体mRNA的高效测序，该技术被用于研究铜绿假单胞菌对宿主细胞的细胞内感染，通常每个宿主细胞涉及不到三个侵染的细菌细胞。
scDual-seq与PatH-Cap结合能够证明细胞内细菌中的快速基因表达适应，并揭示了NF-kB宿主细胞信号对膀胱上皮细胞内细菌存活的必要性，这种联合方法也能够确定结核分枝杆菌和小鼠巨噬细胞之间的动态宿主-病原体关系，虽然感染的巨噬细胞似乎降低了细胞内铁的利用率，但细胞内结核分枝杆菌细胞增加了与铁清除相关的基因的表达。
虽然PatH-Cap受其靶标转录组注释水平的的限制，但其丰富低丰度靶点的能力可能在复杂人体微生物组样本的研究中具有一定的应用前景。在微生物群落的正常免疫调节过程中，识别这种动态和特定宿主-微生物相互作用的能力可能对研究细胞内病原体以及宿主细胞与广泛微生物的相互作用非常有帮助。
挖掘人类scRNA-seq数据揭示微生物RNA的深层信息
尽管许多研究集中于有效捕获宿主和微生物mRNA，但最近的证据表明，在现有的宿主scRNA-seq数据集中可能隐藏着大量的微生物转录信息。最近有几个研究小组开发了以无意捕获的微生物mRNA的形式挖掘宿主scRNA-seq数据以获取此类信息的方法。尽管在这些数据集中微生物RNA的存在历来被认为是有害的污染，但现在有几个研究小组正在证明这些无意中捕捉到的微生物序列能够阐明一系列宿主微生物群的相互作用。
其中第一种方法称为Viral-Track，该技术可以同时分析受感染的宿主细胞，并对相关病毒进行分类分析。Viral-Track能够成功地在人类临床样本中分化出乙型肝炎感染细胞，并识别与病毒复制相关的特定宿主因素，Viral-Track的作者还将该方法应用于COVID-19患者的支气管肺泡灌洗（BAL）样本，绘制了一系列患者免疫反应的细胞和病毒图谱，揭示了病毒感染对轻度和重度疾病患者免疫细胞的不同影响。
宿主scRNA序列挖掘方法现在也被应用于特定病原体以外的真多所有微生物群落的研究。这方面的第一个例子来自最近一项调查COVID-19的研究，该研究对宿主scRNA序列数据进行了挖掘，以获得微生物相关的测序数据，从而研究肺部微生物组在疾病进展中的潜在作用。
该文作者应用一套自开发的工作流对来自COVID-19患者和非COVID-19疾病肺炎对照者的BAL样本的scRNA-seq数据进行处理，与Viral-Track类似，该工作流设计用于从宿主scRNA序列数据中发现宿主细胞相关的微生物转录本，对其进行分类分析，并表征不同宿主细胞类型的差异微生物丰度。
该方法确定了与宿主免疫细胞，特别是中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，相关的细菌子集。值得注意的是，该方法发现细菌与单核细胞和巨噬细胞的联系是COVID-19患者特有的。免疫细胞中的这种表达谱表明，在这些样本中发现的细菌可能是加剧这些严重COVID-19患者炎症的机会性病原体，然而，本研究无法阐明这些相关性是由COVID-19还是机械辅助呼吸引起的，因为大多数COVID-19患者使用了机械辅助呼吸，而对照组则没有。总的来说，本研究清楚地证明了scRNA-seq挖掘方法在揭示和阐明人类微生物组和宿主细胞之间复杂且潜在的临床意义重大的关系方面的威力。
scRNA-seq挖掘方法的另一个最新方法是细胞类型特异性细胞内微生物的鉴定（CSIMicrobes），该方法最初在接触沙门氏菌的人类免疫细胞的两个scRNA-seq数据集上进行了测试，将CSIMicrobes应用于通过Smart-Seq2平台从肺癌样本生成的数据，鉴定出16种与肺癌相关的物种，该算法还能够识别与肿瘤、免疫和基质细胞相关的细菌的差异丰度。随后对宿主细胞基因表达模式的分析还发现感染肿瘤细胞中抗原处理和呈递的下调，提示细胞内细菌和肿瘤细胞之间存在互惠关系。
追溯性scRNA-seq数据挖掘方法的一个常见局限性是，它们受到原始scRNA-seq方法测序质量以及捕获微生物RNA的能力的限制，此外，如何区分测序过程中的污染序列与宿主相关微生物RNA序列也需要严格的对照和过滤策略。
当然，通过适当的方法，这些scRNA-seq挖掘方法可以为宿主微生物相互作用提供重要的初步见解和假设，虽然在宿主scRNA-seq数据中捕获的微生物RNA水平较低，以及通过基于polyA的捕获方法引入的偏差阻碍了完整、定量的功能表征，但最近的这些研究证明，从scRNA-seq数据中进行微生物分类学鉴定是可以实现的。
结论和展望
人类相关微生物群落的巨大异质性早已得到承认，但直到最近，单细胞生物学领域的技术发展才允许我们尝试去揭示这些生态系统中的个体变异性。然而，对于不同单细胞技术的应用，目前仍处于不同的发展阶段。尽管单细胞细菌分离和培养以及单细胞DNA测序已成功应用于环境和人类相关微生物组，甚至存在一些商业平台，但由于各种并未解决的问题，例如复杂群落中细胞壁结构的多样性、低mRNA丰度或低mRNA稳定性，微生物单细胞转录组学的研究仍主要集中在培养菌株上。
尽管存在这些局限性，在一定程度上已经证明了，即使在宿主相关组织中，单细胞方法也可以捕获细菌序列，这为开发联合宿主-微生物组单细胞基因组学和转录组学方法打开大门，这将有可能提供在单个细胞水平上解开复杂宿主-微生物组相互作用所需的技术基础。
开发微生物单细胞技术不应该是最终目标，我们应该将其视为改善目前对人类微生物组的理解的工具，其可以识别和表征低丰度成员，探索微生物组或菌株内功能变异性，以评估它们如何影响生态系统水平的行为。
例如，最近有研究表明，饮食直接影响肠道微生物组中普遍存在的Bacteroides thetaiotaomicron的突变，单细胞技术可能用于确定饮食改变引起的特定突变如何导细菌子集的基因表达变化，从而改变更高层级的适应性，并最终影响这些变体的生长。
此外，单细胞测序技术需要与宏基因组学和宏转录组学，甚至宏蛋白组学和宏代谢组学整合，从而更深入的理解人类微生物组。例如，单个细菌的基因表达甚至生长可能取决于通过其它共生物种的交叉喂养，因此，需要结合整体性的方法来分离和研究这些微生物群成员。
基于以上论述，单细胞方法的开发应致力于使这些工具广泛适用于微生物组研究人员，使现有技术标准化，使其价格合理且可并行化，只有这样，才能深入探索人类微生物群中微生物菌株和功能的巨大多样性，以及它们与宿主相互作用的机制。
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