向NCBI上传16S rDNA数据的操作详解

写在前面的话

百度了一下，发现并专门向NCBI上传16S rDNA数据的方法不太多。因为自己有上传数据的需要，所以决定边摸索边写下操作流程。如果这篇博文帮到你的话，还请点赞收藏。

(PS:正文中的登录以及查看引导信息仅仅是我在正式上传数据时去看到的一些帮助信息，也就是从这些信息中找到了上传数据的方法。如果没有时间，直接从提交数据开始看起即可。)

正式进行数据提交前查看到的一些参考信息

登录NCBI上传网页

https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/

登录这个网页可以看到NCBI现在做的比较人性化，直接有搜索框，然后进行操作流程的提示。

直接选择16S rDNA数据，发现有两种方式，在这里我选择SRA：

Sequence Read Archive(SRA)描述上看它允许我们上传未装配的高通量reads数据。提交的数据尽量的不进行处理，也要包括质量数据。
在这里简单的提一下，原始的reads数据文件一般是fastq文件，如果是两端测序，是分为R1和R2两个文件，即正链测序数据和反链测序数据，这些一般是要进行质控（QC）:去除reads两端低质量序列，去除primer，进行正反链的merge，然后再去除嵌合序列，得到我们的clean data，所以SRA可以接受我们未装配的序列，那我们是我们将未经过任何处理的fataq文件上传，其实也是很方便的。
但是，一般高通量数据是包括多个样本的，是通过标签序列来进行区分的，所以多个样本信息应该怎么阐述清楚呢？这个我似乎没有找到答案，最好的通过cutadapt将样本进行分解了。

查看一些引导信息

点击SRA是进行了这个链接https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/about/sra/，以后可以直接进入。

这里有一些要点提示，上面提到了metadata，如果用过qiime平台，应该也接触过metadata，这个metadata信息是存储了样品的一些特征，包括标签序列，采样的环境条件，这个一般来说，特征的选择是没有规定的，我们大可将想到的或者展示的特征都写在里面。
但是，在上传这些序列信息时，NCBI是把一些环境条件，采样条件等信息存在在了Biosample文件里，而metadata里专门了是保存了测序方法等信息 (笔记补充)

这个界面下面有一些SRA的热门问题，我比较关注第一个，从这里感到SRA似乎要求很少。

我门点击NEXT，查看其他的提示：
关于samples的描述需要重要的理解，描述中提到了一个指导链接：https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/template/

这里是指导我们如何定义biosample，给出了很多模版，最好的是给我们了一个过滤器，可以帮我们来快速的找到合适的模版
我们重点看fitter的1和2提示，因为我们有些样品是混合菌群的，所以按照第2条的提示，我们可以观察我们的菌多集中在哪个属，科，目…上，像我是污水处理设施中的样品，所以我只是将其定位到门水平上：Proteobacteria
然后系统给推荐了7个packages，如下：
我比较感兴趣的是MIMARKS speciman,勾选单选框有：
有感兴趣的是污水和污泥，所以再次选中它，拉到最后发现给出了一些模版表格和示例：
我们先去看看示例是什么样子的：

这里的organism比较特殊了，在NCBI的packages这里经常要填具体的菌属。但是在上面的描述中，organism不能包括metagenome，但是示例中还是有metagenome。

另外，我们看到了Bioproject，有all samples，我们打开看看：
可以看到有三个样品。所以我们在bioproject是可以定义多个biosample的，如果是这样 的话，那每一个biosample就应该对应一个fataq文件的。

让我们反过来看biosample的define：
注意有些属性是必填的，有些是每组最少要填写一个的。biosample中要填写的属性很多，这个需要结合示例自己去摸索。

另外在file中，要求了上传文件名和metadata中提到的文件名要完全的一致
官方的引导信息我们就先了解这么多，下面开始进行数据的上传

正式的数据提交过程

总体上数据提交过程，可以分为三步：

• 创建bioproject
• 创建biosample
• 上传序列

也可以参考官方给的指导https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/docs/submitportal/

Aspera提交工具

在提交前，最好是下载一下Aspera这个程序，然后点击New submission。

Aspera分为命令行工具和浏览器插件。命令行工具速度比较快，但是配置稍微有点麻烦。当前，一般数据小于10g，文件数小于300的都可以使用浏览器插件，实测2G左右的文件上传12min左右。浏览器插件的安装和使用很简单，分为两步：

• 下载浏览器插件
• 下载客户端，IBMAsperaConnectSetup-ML-3.11.2.63.EXE

然后直接直接在网页上选择文件进行提交进行，客户端会自动的识别并与浏览器产生联系，进行数据上传。

而本文介绍的是的是命令行工具的使用：CSDNx下载链接或者官方下载链接

创建bioproject

1. 第一步是填写个人的信息，这个需要登录NCBI。没有账户的需要注册账户
2. 第二步是填写一些基本的项目，样品以及发布日期等基本信息：
   
3. 第三步是添加对bioproject的描述：

创建biosample

4. 第四步是创建biosample一级确定biosample的类型，**注意要最后要选择bath\multisample而不是single sample(single只能通过在线填写信息，而不是使用模版)*。sample type这个跟我们之前浏览过的内容是一样的。(关于biosample的模版文件.xlsx中的属性的填写，请看我博客最后面的介绍)：选择好模版后，就要进行创建biosample这个过程，建议是将excel文件下载好了，然后选择把属性都填好后，再去上传。上图中的MIMARKS.specimen.wastewater.5.0.xlsx便是模版文件
   如果属性有错误的话，会直接给我们报错的。

编写metadata以及上传序列数据

6. 如果没错就可以进入metadata的填写，metedata主要填写是有关测序的类型，建库方法以及测序平台等信息，需要注意的点在于：sample_name要和前面的biosample的一致性，还有filename要和实际上传的文件名一致，要包括fastq等后缀，另外压缩包只支持tar，而且要说明tar包含哪些文件。
   我实际的填写文件如下：
   注意图中有一个 design_description，这里其实就是写样品处理以及测序的方法，简单写即可。

7. 接下来到了正式上传文件的步骤，在这里推荐使用NCBI的aspera这个命令行工具进行上传，点击Preload folder not selected。比较重要的是需要先下载aspera命令行工具，并将该软件的bin文件夹加入到path环境变量中：如我的软件E:\aspera内，bin路径，为E:\aspera\cli\bin，加入到环境变量中：
   
   要注意下面图中的subasp@这里给你的是你项目中的上传文件目录。上传命令会用到：这里最下面有个get key file，这个下载，然后保存到本地，然后上传时要用到：
   
   

ascp -i E:\Aspera\aspera.openssh -QT -l100m -k1 -d F:\upload subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/xxxxxx_NBhh3yeo

# ascp还有一条代理的属性 如果有能力的话，可以加入 -x ip[:port]属性。以PCA模式为例，我的端口是10809，则为 -x 127.0.0.1:10809

上传后选择select preload folder进入文件，刷新数据，需要点时间，文件也会慢慢的刷新出来：
全部刷新后use selected folder就行。
7. 最后一步就是submit，观察一下界面给出的信息，如果没有提交即可

查看上传数据的结果

2020年7月8日3点左右开始上传，9日上午九点就发现了SRA通过了，并且得到了SRR的号。
点击最下面的查看和管理数据，有：
发现经过操作，是自己生成了6个Biosample，对应了6个SRA，然后属于同一个Bioproject。这样，我们可以看到，SRA其实就是存放Biosample的实际的测序信息的，而样品和测序文件组成了我们的项目。我们可以从bioproject中进行biosample和SRA等信息的查看和修改：

提交过程中的发现问题的总结（不定时更新中）

• 在上传biosample时，biosample type应该选择bath/multisample,这时才会有选项，选择是使用在线的表格上传，还是上传.xlsx或.tsv表格。不管是上传一个biosample还是多个biosample，建议都选择bath/multisample,比较方便
• 在2021年4月27日上传multisample类型的数据时，发现我们在编写MIMARKS.specimen.wastewater.5.0.xlsx这个文档时，提示了identical error。排除数据后发现，时文档中包含23个样本，而样本的信息都差不多，所以系统判断这些样品可能时同一个样品。我们的解决方法是，在采样时间那一列，使用yy-mm-ddTHH:MM:SS这样的格式标记时间，而各个采样时间是不同的，如：2021-04-27T19:31:42和2021-04-27 19:32:09。这样可以通过，而且系统会自动的将时间变为2021-04- 27
• 2021.04.27在编辑SRA 序列的metadata数据的文档中，发现原来的biosample name列变成了biosample_accession，且填写的应该是biosample的SAMNXXX编号

总结

上传16S rDNA或者其他数据，是大同小异的，可以通过官网介绍的这种 wizard（向导方法），也可以单独的上传biosample以及bioproject，然后在SRA中进行链接。

其他的发现

1. 在我的提交中，在biosample处，发现我们选择批量样品模板的时候，会引向我们上文提到的链接：https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/template/。也就是说这个模板其实是批量上传模板。

   在单独上传Biosample的时候，会有一个Single BioSample，这里是上传一个biosample

2. 在填写environment样品时，填写一些参数，如env_broad_scale，这样的参数，NCBI描述如下：

Add terms that identify the major environment type(s) where your sample was collected. Recommend subclasses of biome [ENVO:00000428]. Multiple terms can be separated by one or more pipes e.g.: mangrove biome [ENVO:01000181]|estuarine biome [ENVO:01000020]

其实是要求我们使用一种规定的属于，这是来自Environment Ontology,网址：http://www.environmentontology.org/通过NCBI对biosample样品属性的一些规定来自：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/docs/attributes/。这里对属性的描述特别的全面：

联合ENVO可以完成biosample中各种属性的书写。

另外，当我们选择好biosample的模板时，我们点击define，会出现针对于我们所选模版的biosample的属性列表，这个列表也提示了我们哪些属性是必填，还是选填的。如我选择了Package MIMARKS: specimen, wastewater; version 5.0，然后点击define，就出现了以下的界面：

然后再查看一些需要ENVO上查询的属性，可以看到需要ENVO上查询的属性，后面基本上是要求填写{term}类型的，这些描述比较精简，看不懂的可以去看上文提到的attitudes，
3.后面找到了搜狐网的两篇链接，发现也不错，现在分享给大家，看过这些内容，大家已经可以轻松的把数据上传了：

高通量测序数据上传指南

技术帖|手把手教你原始数据上传NCBI（2019版）

官方指导文档