整合ATAC-seq和RNA-seq鉴定水稻病毒感染转录因子

2024年3月19日，宁波大学燕飞研究员团队在植物病理学主流刊物Molecular Plant Pathology上发表题为“Integrated ATAC-seq and RNA-seq data analysis identifies transcription factors related to rice stripe virus infection in Oryza sativa”的研究论文。本研究利用水稻条纹病毒（RSV）感染水稻，研究病毒诱导的染色质可及性变化。研究分析在ATAC-seq感染RSV的水稻中总共鉴定了6462个开放和3587个封闭的差异可及染色质区（DACR）。此外，通过整合ATAC-seq和RNA-seq，鉴定了349个开放式DACR中的上调基因和126个封闭式DACR的下调基因，其中34个转录因子（TF）通过上游基序的搜索得到进一步鉴定，8个转录因子的转录水平通过RT-PCR得到验证。还发现这些TF中的四个（OsWRKY77、OsWRKY28、OsZFP12和OsERF91）与RSV蛋白相互作用，因此被预测在RSV感染中发挥重要作用。这是首次应用ATAC-seq和RNA-seq技术分析RSV感染引起的水稻染色质可及性的变化。整合ATAC-seq和RNA-seq提供了一种新的方法来选择应对病毒感染的候选转录因子。

 研究背景 

ATAC-seq是一种用于鉴定开放染色质区域的技术。ATAC-seq方法使用过度活化的Tn5转座酶将序列衔接子插入染色质的开放区域，然后分析DNA测序数据，推断染色质每个区域、TF结合位点和核小体位置的可及性。染色质的可及性反映了调节因子与开放染色质结合的状态，可及性的开放性反映了染色质调节基因表达水平的能力。因此，染色质可及性分析通常用于研究转录调控的上游机制，并寻找调节差异可及染色质区（DACR）内基因表达水平的关键转录因子。转录因子在应对昆虫攻击和病原体感染等生物胁迫方面发挥着重要作用。面对这种逆境，许多TF家族，包括ERF、MYC、MYB和WRKY，在对细菌、真菌或病毒感染的反应中差异表达。动物研究表明，病毒感染会导致宿主染色质可及性的变化，但对感染病毒的植物染色质可及性的变化及其潜在影响知之甚少。

 技术路线 

 研究结果

1. 水稻条纹病感染过程中染色质可及性的变化

进行ATAC-seq数据分析，通过比较未感染（Mock）和RSV感染的水稻种子来确定RSV感染下水稻染色质可及性的变化。作者使用Macs2在RSV样本中鉴定了59228个可及染色质区（ACRs），在模拟样本中鉴定出64591个ACRs（图1a），这些ACRs在远端基因间和启动子区富集（图1b），分别达93.35%和99.46%。随后在DACR中鉴定了10049个基因，其中6462个peaks在RSV感染后检测到，3587个峰在Mock检测到的（图1c）。研究还统计ATAC-seq片段在所有染色体上的分布（图1d），绘制了转录起始位点（TSS）的上游和下游3 kb的基因的ATAC-seq信号图，并发现TSS区域具有最高的信号，这意味着与其他区域相比，基因的TSS具有更高的可及性（图1e）。

图1：水稻条纹病毒（RSV）感染下水稻种子染色质可及性景观

2. 水稻条纹病毒感染下ACRs的基因分析

为了探索RSV感染过程中开放或封闭ACR的生物学功能，作者对已鉴定的基因进行了GO和KEGG富集（图2a，b）。GO富集显示开放式ACR相关基因在细胞代谢过程和生物调控的生物学过程中显著富集，在碳代谢和氨基酸生物合成相关途径中显著富集。在KEGG富集中鉴定了自噬途径。然而，在GO中氧化还原酶活性的生物过程中，以及在KEGG中次级代谢产物的生物合成和苯丙烷生物合成相关途径中，闭合的ACR相关基因显著富集。

图2：水稻条纹病毒（RSV）感染下可及染色质区（ACR）基因的分析

3. ATAC-seq和RNA-seq的联合分析

为了进一步研究在RSV感染下DACR介导的转录调控细节，在未感染和RSV感染的水稻种子上分别进行了三个重复的RNA-seq实验。对转录组数据进行了火山图可视化（图3a），共鉴定出5461个差异基因。其中，2632个基因上调，2829个基因下调（图3a：绿点表示下调的DEG分布，红点表示上调的DEG的分布，蓝点表示无显著变化）。

通过整合ATAC-seq和RNA-seq数据分析，共筛选出1395个DEG（图3b）。在RNA-seq和ATAC-seq联合分析结果中，具有开放-DACR介导的上调和封闭-DACR中介的下调关系的基因被标记为红色。其中，349个开放-DACR介导的下调相关基因和126个封闭-DACR中介的下调相关基因被鉴定。通过整合RNA-seq和ATAC-seq分析获得的这些基因可能在RSV感染或RSV与宿主蛋白之间的相互作用中发挥重要作用，因此需要进一步研究。

图3：ATAC和RNA-seq联合分析

4. 联合分析基因的GO和KEGG途径富集分析

ATAC-seq和RNA-seq的DEGs进行GO富集发现水稻条纹病毒感染后，瓜氨酸相关的生物合成过程、细胞壁生物发生、核酸结合、细胞过程调节、生物调节、生物过程调节和初级代谢过程调节发生了显著变化（图4a）。这些结果表明，细胞壁成分和一些重要氨基酸的生物合成可能是响应RSV感染而启动的。

KEGG富集发现最显著相关的途径集中在细胞周期变化和细胞代谢途径上。RSV感染后，植物-病原体相互作用、甘油磷脂代谢、MAPK信号通路-植物、代谢通路以及淀粉和蔗糖代谢发生了显著变化（图4b）。这些代谢过程可能在水稻对RSV感染的反应中发挥重要作用。

图4：可及染色质区差异表达基因的GO和KEGG途径富集分析

5. TF的识别、验证和可视化

DACR通常与转录因子相关，以调节基因表达。因此，为了确定在水稻条纹病毒感染过程中可能发挥关键调节作用的转录因子，作者使用ATAC-seq中确定的上游基序在DEG数据中搜索转录因子，共发现34个转录因子。为了进一步验证RNA-seq中这些转录因子的转录变化，作者选择了8个已被报道与水稻生物胁迫有关的基因（OsWRKY77、OsERF91、OsWRKY45、OsWRKY28、OsJAMYB、OsWRKY12、OsZFP12、OsBBX4），并使用RT-qPCR分析了它们的表达（图5a）。结果与RNA-seq结果一致。RSV感染后OsWRKY12和OsBBX4的转录水平下调，OsWRKY77、OsERF91、OsWRKY45、OsWRKY28、OsJAMYB和OsZFP12的转录水平上调。

作者将TOBIAS（通过ATAC-seq信号的研究进行转录因子占用预测的软件）应用于来自Mock和RSV样本的ATAC-seq数据，以探索RSV感染下可见的TF足迹。根据网站（https://jaspar.elixir.no/）分析了转录因子OsWRKY28和OsWRKY45的足迹，据报道，它们在水稻对细菌和真菌疾病的反应中发挥着重要的调节作用。在水稻条纹病毒感染下，OsWRKY28和OsWRKY45的足迹（图5b，左）明显可见。重要的是，在RSV感染下，OsWRKY28和OsWRKY45的总可能结合位点分为结合位点和未结合位点（图5b，右）。这些数据表明，TOBIAS可以提供对TF活性的重要见解，特别是对进一步揭示其靶基因。

图5：RT-qPCR验证和TOBIAS可视化。

6. 已鉴定的转录因子与病毒蛋白之间的相互作用

为验证这些转录因子是否能直接与水稻条纹病毒蛋白相互作用情况。作者对它们的相互作用关系进行了相关验证。首先，使用BiFC鉴定了上述筛选的TF（图5a）和RSV蛋白之间的相互作用。随后，通过萤光素酶互补成像测定进一步验证了这些相互作用。OsWRKY28特异地与RSV p3相互作用，这种相互作用在共免疫沉淀（CO-IP）分析中得到了验证（图6a）。

此外，作者还使用STRING网站（https://cn.STRING-gdb.org/）分析了OsWRKY28的相互作用蛋白网络图（图6b）。OsWRKY28被预测与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和bZIP转录因子相互作用，据报道，它们在调节宿主的免疫反应过程中发挥重要作用。总的来说，这些结果将为进一步研究这些转录因子如何调节水稻条纹病病毒感染提供见解。

图6：已鉴定的转录因子与水稻条纹病毒（RSV）蛋白之间的相互作用。

 总  结 

植物的生长受各种因素如生物胁迫病毒、病原菌等干扰，从而对全球植物生物多样性和粮食安全构成威胁。本文通过ATAC-seq和RNA-seq鉴定到RSV感染过程中相关的关键转录因子，并验证了这些转录因子与水稻条纹病蛋白之间的互作，为进一步研究这些转录因子如何调节水稻条纹病病毒感染提供见解。