New Phytol | 植物miRNA-转录因子-靶基因模块调控网络如何构建

microRNA被认为是在转录后水平调控基因表达的关键调节因子，已被发现参与了植物的生物过程。比如在植物发育、应激响应和二次代谢过程中，发现了一些微小RNA上调或下调。

过去几年，多篇报道已经证明miR160与各种物种中不同组织和器官发育直接相关，以及植物与环境相互作用。miR160-ARF模块对植物重要性状的贡献较多，而且由于其普遍存在的特质以及多样的改良可能性，使其成为作物育种的备受期待的遗传操作靶点，因此不少研究以“miR160-ARF”模块为研究的切入点。

近几年“miR160-ARF模块”相关研究文章

图：miR160-ARF模块在植物中的作用。(A) miR160-ARF在不同植物生长发育过程中的作用列表。(B) miR160参与的植物胁迫响应摘要。蓝色表示基因下调;红色代表基因上调。[1]

本期，我们带来了一篇来自山东农业大学和广州大学研究团队发表在New Phytologist题为“A novel miR160a-GmARF16-GmMYC2 module determines soybean salt tolerance and adaptation”的研究论文。该研究鉴定了一个miR160a-GmARF16-GmMYC2模块，并研究其在大豆盐胁迫反应中的调控。通过这篇文章，我们来看看miRNA-转录因子-靶基因模块的调控网络研究思路有哪些值得参考的。

• 中文标题：一个新的miR160a-GmARF16-GmMYC2模块决定了大豆的耐盐性和适应能力

• 期    刊：New Phytologist

• 影响因子：9.4

• 发表时间：2024年5月

• 研究单位：山东农业大学和广州大学

研究背景

盐胁迫是对大豆生长和产量产生负面影响的主要挑战。因此，了解盐响应的调控机制对保证这种条件下的大豆产量具有重要意义。miR160-ARF模块是提高作物抗逆性的潜在工程靶点。然而，还需要进一步的机制理解来充分阐明该模块参与非生物应激反应的分子细节。研究团队之前通过利用盐响应转录组数据重新分析盐胁迫8小时下miRNA前体序列的表达，发现miR160家族成员在大豆中表现出对盐胁迫的反应。然而，miR160及其靶基因在盐胁迫响应中的确切作用值得进一步研究。

技术路线

研究结果

1. 大豆miR160a作为响应盐胁迫的正调控因子

MicroRNAs（miRNAs）在植物发育和响应环境胁迫中发挥作用，并可通过引起mRNA降解和翻译抑制来诱导基因沉默。MiR160是一种已知的miRNA，通过靶向生长素反应因子（ARFs）ARF10、ARF16和ARF17来调控种子萌发、下胚轴伸长和叶片发育。大豆miR160家族由6个高度保守的成员组成。这些基因根据其前体序列可分为两个分支：miR160a/b和miR160c/d/e/f。

为了探讨大豆miR160基因在盐胁迫响应中的潜在作用，作者利用茎环法实时定量PCR在野生型东农No. 50的根中检测了它们的表达水平。在盐胁迫下，miR160a/f的差异表达（>2，P<0.05）强于miR160b/c/d/e。为了区分miR160a和miR160f，作者在已发表的盐反应转录组数据中重新评估了它们的前体的表达。盐处理后，miR160a前体的变化有统计学意义，而miR160f前体丰度变化无统计学意义。通过这种响应盐胁迫的表达模式，miR160a可能在适应环境胁迫中发挥了关键作用。

为了研究miR160在大豆盐胁迫中的功能，研究构建了突变体：miR160a-OHR（超表达）和STTM160a-HR（抑制）。在无盐度的正常生长条件下，miR160a-OHR、STTM160a-HR和CHR（对照）幼苗的表型无明显差异。然而，与CHR植株相比，在含有120 mM氯化钠的培养基上生长6d后，miR160a-OHR植株更耐盐胁迫，具有更健康的叶片和更长的主根。与此相比，与CHR植株相比，STTM160a-HR植株的抗性较低，叶片黄化，显著阻碍了根系生长。这些结果表明：miR160a正向调控大豆的耐盐性。上面构建的转基因是通过毛根转化得到的，为了进一步研究功能，研究构建了稳定转化的突变体，并且观察到了类似的表型。因此，这些数据证实了miR160a在大豆耐盐性中的作用。

2. GmARF16是miR160a的一个靶点，对盐胁迫有反应

在植物中，miRNAs主要通过切割靶基因的mRNA来调控基因的表达。为了研究miR160a如何促进大豆的耐盐性，研究团队使用psRNATarget预测其靶点，并鉴定了13个具有miR160a结合位点的候选基因。

利用RT-qPCR检测它们的表达水平，发现GmARF16 (Glyma.19 g181900)差异表达量最强，其表达量与miR160a呈负相关。为了探究GmARF16在miR160a诱导下的表达，作者分析了其在野生型DN50、miR160a-OE和STTM160a转基因株系中的表达。与DN50植株相比，miR160a-OE植株GmARF16的表达量降低，而抑制miR160a活性的转基因STTM160a植株GmARF16的表达量高于DN50植株。此外，RLM-5’ RACE证实了miR160a切割GmARF16 mRNA的特异性位点。这些观察结果表明，GmARF16是miR160a的一个靶点，其表达受到miR160a的调控。器官表达图谱分析和亚细胞定位分析结果表明GmARF16编码一个核定位的转录因子。

3. GmARF16对大豆的耐盐性有负向影响

研究构建了GmARF16的突变体，表型数据表明GmARF16是大豆耐盐性的负调控因子，可作为提高耐盐性工程策略的靶点。

4. 盐胁迫下GmARF16下游靶点的鉴定

为了进一步探索miR160a介导的GmARF16表达重编程如何影响大豆的耐盐性，研究首先利用过表达GmARF16的植物（GmARF16-OE）和野生型DN50植物的根样本进行了RNA测序。结果共鉴定出1733个差异表达基因（DEGs），其中上调基因766个，下调基因967个，其中一些可能在调节耐盐性中发挥作用。GO分析显示GmARF16不仅响应生长素途径，而且还响应非生物胁迫（包括4个下调基因和9个上调基因）。

为了研究涉及GmARF16的遗传途径，并识别直接受GmARF16调控的基因，研究采用ChIP-seq来鉴定GmARF16的全基因组结合位点。随后，通过MACS3在整个基因组中鉴定出了2048个代表GmARF16-GFP结合位点的峰。在2048个峰中，有316个（15%）被定位于包含基因体的基因区域及其3kb的侧翼区域。在316个基因定位位点中，19、24、20、10、7和20%分别位于启动子区域、编码序列、内含子、5’UTR、3’UTR和转录终止子。使用HOMER预测GmARF16的结合motif。NNGACA基序在常见峰中最为普遍，在58.9%的峰范围内发现。这些基序可以作为GmARF16或其相互作用的转录因子结合的顺式元件。

接下来，为了鉴定直接受GmARF16调控的盐胁迫响应基因，研究整合了RNA-seq和ChIP-seq数据集，取它们重叠的基因集。共有51个靶点被鉴定为差异表达基因（DEGs）。其中，17个基因表达下调，其余34个基因表达上调。在这些DEGs中，文献报道过拟南芥AtMYC2同源物的GmMYC2通过调节脯氨酸的生物合成而降低了耐盐性。GmMYC2在GmARF16-OE植株中的表达有较强的上调，表明大豆耐盐性可能受到GmARF16依赖的GmMYC2诱导的调控。

图4：在GmARF16过表达系中全基因组鉴定GmARF16结合位点、motif和基因

随后，作者进行ChIP-qPCR、EMSA、LUC实验，结果支持了GmARF16可以通过直接与其启动子中的NNGACA基序结合来激活GmMYC2的解释，这与miR160a-GmARF16-GmMYC2模块在调节大豆耐盐胁迫中发挥作用的假说相一致。

图：GmARF16通过直接结合启动子区域激活GmMYC2，赋予盐敏感性。

5. GmMYC2通过调节脯氨酸的生物合成，对大豆的耐盐性产生负面影响

为了进一步了解GmMYC2在大豆盐胁迫反应中的作用，作者构建了GmMYC2过表达和RNAi载体，并利用毛-根转化体系生成了复合转基因植株。对其进行盐胁迫实验，发现结果与转基因GmARF16过表达或敲除突变的大豆植株的表型结果一致。转基因毛根中进行了遗传互补试验，以确认GmARF16-GmMYC2和miR160a-GmMYC2之间在盐耐受性方面的遗传关联。在GmARF16过表达背景下抑制毛根中的GmMYC2恢复了盐耐受性，在GmARF16-RNAi背景中过表达GmMYC2导致了盐耐受性的丧失，体现为叶片发黄、基因表达差异和根部伸长趋势。这些发现进一步证明了GmMYC2是GmARF16在大豆耐盐性研究中的主要靶点。

脯氨酸在大豆对盐胁迫的适应过程中起着关键作用。先前的研究表明，MYC2可以通过抑制脯氨酸生物合成的限速酶“delta 1-吡咯林-5-羧酸合成酶1（P5CS1）”的表达来调节脯氨酸合成，脯氨酸生物合成的限速酶。在该研究中，相对于DN50对照，GmP5CS1在转基因系中表达下调，而在GmMYC2-RNAi转基因系中GmP5CS1表达上调。这些观察结果表明，GmMYC2对GmP5CS1的表达有负向影响。然后，研究测量了GmMYC2过表达和RNAi复合植株根中的脯氨酸含量。在正常条件下，GmMYC2 RNAi转基因植株根系中的脯氨酸含量高于对照株。在120 mM氯化钠条件下，与野生型植株相比，GmMYC2 RNAi根中脯氨酸积累显著，而过表达GmMYC2的根中脯氨酸含量下降。

研究还测量了GmARF16和miR160a稳定转基因株系中的脯氨酸浓度，发现STTM160a和GmARF16过表达植株中脯氨酸含量较低，而盐胁迫下GmARF16 RNAi植株中脯氨酸含量过积累。这些结果与不同转基因大豆品系对盐暴露的响应相一致。在正常和盐胁迫条件下确定了转基因植株（miR160a、GmARF16、GmMYC2）中的Na+含量和Na+:K+比值。经过6天的盐胁迫后，miR160a-OE、GmARF16-RNAi和GmMYC2-RHR转基因植株积累的Na+较少，Na+:K+比值较低。相反，STTM160a、GmARF16-OE和GmMYC2-OHR转基因植株的Na+含量和Na+:K+比值较高。根据这些发现，作者得出结论：miR160a-GmARF16-GmMYC2模块调控脯氨酸合成，从而减少渗透胁迫引起的损伤，维持植物对盐胁迫的耐受性。

6. GmARF16的自然变异有助于大豆的耐盐性和局部适应

自然变异往往有助于植物适应不同的环境条件。为了研究GmARF16等位基因变异对大豆耐盐度的影响，研究分析了559份重测序的大豆材料，包括121份野生大豆、207个地方品种和231个改良品种。基于4个SNPs的存在，鉴定出4个单倍型，并命名为GmARF16H1-GmARF16H4。GmARF16H1、GmARF16H2和GmARF16H4在5’UTR中均存在多态性，而GmARF16H3具有一个非同义SNP，由于基于Williams 82作为参考基因组的编码序列的1812位鸟嘌呤被腺嘌呤取代，导致氨基酸从精氨酸取代为赖氨酸。

为了研究不同单倍型与耐盐性之间的相关性，研究通过双荧光素酶报告基因分析来了解GmARF16启动子活性的功能结果。5’UTR单倍型的相对LUC活性没有明显的差异。然后，研究检测了GmARF16的编码区，并评估了它们的激活能力，由于G-A的替代，导致了不同的转录活性。与其他单倍型相比，GmARF16H3激活GmMYC2pro：LUC的能力相对较弱。使用EMSA检测了GmARF16H2和GmARF16H3与GmMYC2启动子的结合活性。与GmARF16H2相比，GmARF16H3对GmMYC2启动子的结合活性较弱。此外，与GmARF16H2相比，GmARF16H3存在下GmMYC2表达较低（图7e，f），这与EMSA实验中观察到的较弱的结合活性一致。

接下来，研究团队评估了毛状根的单倍型功能，发现正常条件下根伸长无统计学差异（图7g,h）。然而，在120 mM氯化钠下，大豆根系伸长和生长一般缺陷的差异具有统计学意义。GmARF16H2和GmARF16H3转化的毛根在盐处理下根伸长均降低，但GmARF16H3对盐胁迫的耐受性优于GmARF16H2，是大豆适应盐环境的有利单倍型。

图7：人工选择下的GmARF16单倍型变异及地理分布。

生信分析表明，在这里查询的野生大豆种群中，GmARF16H3 显然不存在，但其比例从地方品种增加到培育品种（2.44-33.95％; 见图 7i）。地理分析显示，GmARF16H3主要存在于黄淮海地区（纬度 32°-40°N，经度114°-121°E）及周围地区的起源种群中，该地区土壤含盐（见图7j）。这些结果表明，GmARF16H3经历了人工选择，以使其适应盐碱性，从而使其成为大豆育种中增强耐盐性的有希望的候选品种。

研究总结

该研究提出了一个基因调控网络模型，包括miR160a–GmARF16–GmMYC2，在大豆适应盐胁迫过程中发挥关键作用，影响脯氨酸生物合成。单倍型分析显示，GmARF16H3已被人工选育以耐受盐碱环境，可用于指导高盐地区大豆改良。本研究揭示的调控机制揭示了盐胁迫信号传导和改良策略。

大豆盐胁迫反应中miR160a-GmARF16-GmMYC2调控网络的模型

 爱基小结 

在植物miRNA研究策略中，主要运用到三类关键技术。首先是miRNA定量，这一技术用于测量和分析miRNA的表达水平，从而了解其在不同生长阶段或环境条件下的动态变化。其次是靶基因预测，通过生物信息学工具和算法，根据miRNA的序列特征来预测其可能调控的靶基因，这一步至关重要，因为它为后续的验证研究提供了候选基因列表。最后是靶基因验证，通常通过分子生物学实验，如荧光素酶报告基因检测、降解组、RLM-5’RACE和功能验证等方法，验证预测的靶基因是否真正受到miRNA的调控。这些技术的综合应用，使得研究人员能够深入理解miRNA在植物生长发育和环境响应中的功能机制。

在植物中，microRNA+转录因子的组合除了“miR160-ARF”模块外，还有很多其他模块比如：“miR156-SPL”、“miR396-GRF/GIF”等。这类研究，都可以参考如下思路。

• 参考文献

[1] Hao K, Wang Y, Zhu Z, Wu Y, Chen R and Zhang L (2022) miR160:An Indispensable Regulator in Plant.Front. Plant Sci. 13:833322. doi: 10.3389/fpls.2022.833322