免疫共沉淀技术（CoIP）

免疫共沉淀技术（CoIP）实验技术介绍

一、技术概述

实时荧光定量PCR（qPCR）是一种强大的分子生物学技术，通过在PCR反应中加入荧光基团，能够实时监测PCR进程，并进行定量分析。

二、实验目的

本实验使用靶向目标蛋白的特异性抗体（GST-ATF3）选择性地捕获目标蛋白质与其相互作用的分子进行免疫共沉淀，然后使用LC-MS/MS鉴定和定量这些复合物中的单个蛋白质。

三、实验流程
1. 样本前处理

a. 小心去除贴壁细胞的培养基;

b. 离心收集细胞到1.5ml离心管中；

c．用 PBS 洗细胞一次；

d. 向细胞中加入冰浴预冷的IP 裂解/洗涤缓冲液；冰上孵育 5 分钟，期间混匀几次；

e. 4℃，13000×g 离心 10 分钟，沉降细胞碎片;

f. 将上清转移到一个新管中，进行蛋白浓度测定及后续实验;

2. 抗体结合反应

a. 轻微涡旋或用旋转仪彻底混匀瓶中磁珠;

b. 将 25 µL的 Pierce 蛋白A/G 的磁珠加入 1.5 mL 离心管中;

c. 向磁珠中加入 175 µL IP 裂解/洗涤缓冲液，轻微涡旋混匀;

d. 将离心管放入磁力架中收集磁珠到离心管的一边,去除上清;

e. 向离心管中加入1 mLIP 裂解/洗涤缓冲液。颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1分钟。用磁力架收集磁珠，弃上清。

f. 将抗原样品/抗体混合物加入盛有磁珠的离心管中，4摄氏度孵育过夜；

g. 用磁力架收集磁珠，弃上清；

h. 向离心管中加入500 µL IP裂解/洗涤缓冲液，轻柔混匀。收集磁珠，弃上清。再重复洗两次。

i. 向管中加入500 µL超纯水，轻柔混匀。用磁力架收集磁珠，弃上清。

j. 低pH 洗脱：向离心管中加入100 µL洗脱液；在室温下孵育10 min，孵育期间注意混匀。

k. 通过磁力架分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。为了中和pH，每100μL洗脱产物中加入10μL中和液。

l.产物用于后续银染、WB或质谱检测

• 技术优势

✅ 直接检测蛋白质与其他分子（如蛋白质、DNA或RNA）之间的相互作用，提供了定性和定量信息。

✅ 可以在原生条件下进行，更接近细胞内环境，有助于揭示生物体内的相互作用。

✅ 可以研究复杂的蛋白质复合物，包括多个亚基或较大的蛋白质复合物。

✅ 可以通过验证和功能研究进一步验证相互作用的生物学功能

• 适用范围

1️⃣ 蛋白质复合物的鉴定

2️⃣ 构建蛋白质相互作用网络

3️⃣疾病研究（靶点识别与验证、理解疾病机制、生物标志物的发现）

4️⃣蛋白质修饰研究

5️⃣ 整合其他组学数据，提供分子图谱的全面视图

六、代表性实验结果