Plant Biotechnology Journal：应用DAP-seq技术助力揭示GhRCD1调节GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1转录级联反应促进棉花对镉的耐受机制

镉（Cd2+）是环境中最常见的有害重金属之一，严重威胁作物生产力和质量以及食品安全。Cd2+容易被植物从土壤中吸收，并通过可食用的植物器官和谷物进入食物链，对食品质量、粮食安全和公共安全构成威胁。

植物修复是减少土壤污染的有效途径之一。棉花作为一种重要的非食用经济作物，与粮食作物（小麦、水稻和玉米）、油料作物（花生和大豆）和蔬菜（豆类、黄瓜和番茄）相比，在修复土壤Cd2+污染方面具有天然优势，避免了Cd2+进入食物链的风险。因此，探究棉花响应镉胁迫的调控机制至关重要。

2024年1月16日，中国农业科学院棉花研究所李付广研究员团队的研究成果，发表在Plant Biotechnology Journal期刊上（IF=13.8），文章题目是“GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1 transcriptional cascade” 。该研究使用DNA亲和纯化测序（DAP-seq）等分子相互作用研究方法，发现了调节棉花Cd2+耐受性的分子级联反应，揭示了GhRCD1通过调控GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1转录级联通路响应镉胁迫的分子机制，为培育耐镉棉花新品种和通过植物修复手段降低镉污染提供了新思路。

1.突变ghrcd1 基因降低棉花Cd2+耐受性

为探究Cd2+对棉花毒性的分子机制，作者通过T-DNA插入得到对Cd2+敏感的突变体ghrcd1。Cd2+处理后，通过表型观察，RT-qPCR分析，PI染色，叶绿体结构观察，SPAD分析等实验发现，ghrcd1幼苗比WT植株表现出更低的Cd2+耐受性，这表明，抑制GhRCD1表达会降低棉花Cd2+耐受性，GhRCD1在棉花应对镉胁迫时具有正向调节作用。

2.敲除棉花GhRCD1基因，降低棉花Cd2+耐受性

为了进一步研究GhRCD1在棉花耐镉胁迫中的作用，作者构建了KO-GhRCD1株系和OE-GhRCD1株系。Cd2+处理后，通过表型观察，PI染色，叶绿体结构观察，SPAD分析等实验发现，与WT相比，KO-GhRCD1的Cd2+耐受性更低，OE-GhRCD1的Cd2+耐受性更高。这些结果表明GhRCD1能减弱Cd2+对棉花的毒性。

​​​​​​​3.GhRCD1与GhbHLH12在体外和体内均存在相互作用

作者使用GhRCD1为诱饵蛋白，对棉花应激响应蛋白库进行Y2H筛选，结果发现GhbHLH12转录因子与GhRCD1存在相互作用。而后通过BiFC、GST pull down和LCI实验进一步验证了这一结果。这些结果表明GhRCD1与GhbHLH12在体外和体内都能与GhbHLH12相互作用。

4.抑制GhbHLH12表达增强棉花Cd2+耐受性

为探究GhbHLH12是否参与了棉花应对Cd2+胁迫的反应，作者构建了棉花的OE-GhbHLH12株系和GhbHLH1-RNAi株系。Cd2+处理后，GhbHLH1-RNAi的Cd2+耐受性增加，OE-GhbHLH12的Cd2+耐受性降低。为确定GhbHLH12在调节Cd2+耐受性中是否有基因依赖性，作者敲除GhbHLH12得到KO-GhbHLH12株系，Cd2+处理后，KO-GhbHLH12植株比对照植株具有更高的耐受性。这些结果说明，抑制GhbHLH12表达增强了棉花的Cd2+耐受性。

5.GhRCD1减弱GhbHLH12对GhMYB44的转录抑制作用，提高棉花Cd2+耐受性

为探究GhbHLH12抑制棉花Cd2+耐受性的机制，作者对WT幼苗进行了RNA-seq和DAP-seq联合分析。DAP-seq结果显示GhbHLH12在GhMYB44的启动子区域有显著富集，而后，Y1H和EMSA实验证实了GhbHLH12蛋白和GhMYB44的结合基序G-box相互作用。LUC/REN报告实验表明GhbHLH12抑制GhMYB44的转录，而GhRCD1可以减弱GhbHLH12对GhMYB44的抑制作用，EMSA结果也表明GhRCD1减弱了GhbHLH12与GhMYB44的结合，结合RT-qPCR实验结果，说明GhRCD1和GhbHLH12分别是Cd2+耐受性的正负调节因子，并且在Cd2+胁迫下，转录调控存在复杂的相互作用。

6.GhMYB44表达增强棉花Cd2+耐受性

为探究GhMYB44响应Cd2+胁迫的机制，作者构建了GhMYB44-OE1/5株系和GhMYB44-SRDX1/6株系。Cd2+处理后，与WT相比，GhMYB44-OE表现出更高的Cd2+耐受性，而SRDX-GhMYB44-1/6植株表现出更低的耐受性。这表明GhMYB44表达增强了棉花的Cd2+耐受性。随后作者采用VIGS技术沉默对照和KO-GhbHLH12株系中的GhMYB44基因，结果表明GhMYB44在GhbHLH12的下游发挥作用。

7.棉花应对Cd2+胁迫的GhMYB44–GhHMAs转录级联反应

为探究棉花中GhMYB44提高Cd2+耐受性的作用机制，作者利用DAP-seq技术找到GhMYB44的10207个潜在结合位点，其中61.42％位于基因间区，22.31％位于启动子区。GO分析显示，靶基因显著富集在胁迫应答（GhWRKY13和GhWRKY51）和金属离子结合和运输（GhHMA1、GhHMA2和GhHMA5）通路。为研究GhMYB44是否通过GhHMA1和GhHMA5在Cd2+转运中发挥调控作用，作者通过Y1H、EMSA实验验证了GhMYB44特异性结合GhHMA１和GhHMA5的G-box（CATGTG）顺式作用元件。LUC/REN报告实验结果表明，GhMYB44可以直接激活GhHMA1和GhHMA5的转录来调控Cd2+的转运。RT-qPCR分析表明Cd2+诱导GhHMA1和GhHMA5的上调在很大程度上取决于GhMYB44和KO-bHLH12的存在和功能。

为进一步探究GhHMA1和GhHMA5在Cd2+耐受机制中的生物功能，作者采用VIGS技术沉默棉花中的GhHMA1和GhHMA5基因，生成沉默品系，Cd2+处理后，沉默品系对Cd2+表现出更高的敏感性。结果表明GhMYB44-GhHMA1/5信号级联反应正向调控棉花的Cd2+耐受性。

8.GhMYB44和GhPYL8协同调节ABA介导的Cd2+耐受性

为研究GhMYB44是否与ABA受体相互作用介导Cd2+耐受性，作者进行Y2H测定发现GhMYB44与ABA受体GhPYL8相互作用。随后通过BiFC和蛋白pull-down实验验证了这一结果。为研究GhPYL8的生理功能，作者构建了OE-GhPYL8-1/3/6株系，Cd2+处理后，与WT相比，OE - GhPYL8对Cd2+的耐受性更高。这些结果表明GhMYB44可以与GhPYL8相互作用来调节ABA介导的Cd2+耐受性。

小结：

本研究揭示了一个调控级联反应，即GhRCD1–GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1，阐明了棉花耐Cd2+遗传调控的分子机制，为棉花耐Cd2+优良品种的开发奠定了基础，预示着棉花植物修复的新时代。