RNA-seq技术原理

【陈巍学基因】RNA-seq - 知乎

一、基本原理

去除rRNA、tRNA等干扰，因此利用高等生物的mRNA都有Poly(A)尾巴这个特点，用带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交。然后Poly(T)探针就和带Poly(A)尾巴的mRNA结合在一起，接下来就回收磁珠，然后把这些带Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。

第6步在cDNA两端加上A序列，再加上Y型序列，就成了标准的测序文库，这个标准的测序文库就可以拿到HiSeq测序仪上进行测序了。其中第4部得到的能够比对到基因上的片段就是一个read，一个基因能够产生多个mRNA；

一个mRNA能够产生多个read；

基因表达量越高，产生read的数量越多。

二、RPKM

分子是经对到某个基因的外显子的read数；

分母的第一项是这次所有比对到基因组上的read总数（M reads，MillionReads）；

分母的第二项是这个特定基因的外显子的长度。

除read总数是为了求相对reads数；

除外显子的长度是因为如果一个基因的长显子越长，那么它所产生的mRNA就越长，那么mRNA越长呐，被打出来的小片段就越多。

我们来假设，一个A基因，它的mRNA的长度呐，假设它是1Kb，那么它的1Kb的mRNA可能被打成“5”个，200Bp左右的小片段；那么还有一个B基因，如果这个B基因的mRNA是2Kb长，那么，它同样被打成200Bp左右的小片段呐，它就会产生“10”个小片段。我们来看，A基因是5个小片段，而B基因是整整10个小片段，所以，B基因在测序过程当中，它被测到的概率就会比A基因整整大出去一倍。