20190904_chip-seq/ ATAC-seq/DAP-seq 原理理解

染色质免疫共沉淀Chromatin Immunoprecipitation,ChIP 技术是指：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。该技术是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。

它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

反式因子 trans-acting element：是转录模板上游的一类蛋白调节因子，包括激活因子和阻遏因子等，它们与顺式作用元件中的上游激活序列特异性结合，对真核生物基因的转录分别起促进和阻遏作用。

顺式作用元件(cis-acting element)存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。是转录调节因子的结合位点。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。

相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”（trans）。

chip-seq 的原理：将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

实验流程

（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来；

（2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段；

（3）添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体；

（4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序；

（5）将准备好的样本进行深度测序。

 

#ATAC-seq:（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing）是用于研究染色质可及性（通常也理解为染色质的开放性）的方法， 原理是通过转座酶Tn5容易结合在开放染色质的特性，然后对Tn5酶捕获到的DNA序列进行测序。

开放染色质：真核生物的核DNA并不是裸露的，而是与组蛋白结合形成染色体的基本结构单位核小体，核小体再经逐步的压缩折叠最终形成染色体高级结构（如人的DNA链完整展开约2m长，经过这样的折叠就变成了纳米级至微米级的染色质结构而可以储存在小小的细胞核）。而DNA的复制转录是需要将DNA的紧密结构打开，从而允许一些调控因子结合（转录因子或其他调控因子）。这部分打开的染色质，就叫开放染色质，打开的染色质允许其他调控因子结合的特性称为染色质的可及性（chromatin accessibility）。因此，认为染色质的可及性与转录调控密切相关。

开放染色质的研究方法有ATAC-seq以及传统的DNase-Seq及FAIRE-seq等，ATAC-Seq由于所需细胞量少，实验简单，可以在全基因组范围内检测染色质的开放状态，目前已经成为研究染色质开放性的首选技术方法。

#chip-seq 和ATAC-seq 的异同：

ATAC-Seq与ChIP-Seq的不同的是ATAC-Seq是全基因组范围内检测染色质的开放程度，可以得到全基因组范围内的蛋白质可能结合的位点信息，一般用于不知道特定的转录因子，用此方法与其他方法结合筛查感兴趣的特定调控因子；但是ChIP-Seq是明确知道感兴趣的转录因子是什么，根据感兴趣的转录因子设计抗体去做ChIP实验拉DNA，验证感兴趣的转录因子是否与DNA存在相互作用。ATAC-Seq、ChIP-Seq、Dnase-Seq、MNase-Seq、FAIRE-Seq整体的分析思路一致，找到富集区域，对富集区域进行功能分析。

• ChIP-Seq是揭示特定转录因子或蛋白复合物的结合区域，实际是研究DNA和蛋白质的相互作用，利用抗体将蛋白质和DNA一起富集，并对富集到的DNA进行测序。
• DNase-Seq、ATAC-Seq、FAIRE-Seq都是用来研究开放染色质区域。DNase-Seq是用的DNase I内切酶识别开放染色质区域，而ATAC-seq是用的Tn5转座酶，随后进行富集和扩增；FAIRE-Seq是先进行超声裂解，然后用酚-氯仿富集。
• MNase-Seq是用来鉴定核小体区域。

#DAP-seq:(DNA affinity purification sequencing) 是一种高通量TF结合位点发现方法，用体外表达的TFS来询问基因组DNA.  DAP-seq数据集还可以了解到许多TFS的生物学和绑定站点体系结构，（一种高通量的检测方法，使用体外表达的TF来询问裸露的gdna片段，以建立结合位置(峰)和序列基序。）dap-seq是一种体外TF-dna结合试验，它允许低成本快速生成大量tfs的全基因组结合位点图，同时捕获影响体内结合的gdna特性。“我们的系统廉价且可扩展。它使得我们能够捕获全部的转录结合位点，因此我们获得了完整的密码本。为了获得这一顺反组图谱，研究人员构建出了一个系统，在这一系统中他们可以将一个标记的转录因子添加到DNA文库中，让它结合DNA，随后再分离出所有配对DNA-蛋白。这种叫做DNA亲和纯化测序(DAP-seq)的方法，大大扩展了科学家们收集到的关于转录因子及它们结合位点的信息。 在发表于2016年5月《Nature Plants》杂志上的第二篇研究论文中，Ecker与杜克大学和西澳大利亚大学的合作小组揭示出，拟南芥根部不同类型的细胞具有不同的甲基化模式。 

DEP-seq是将亲和纯化的tfs与基因组DNA文库的下一代测序结合起来。

亲和纯化：https://wenku.baidu.com/view/bba854b80029bd64783e2c91.html

 

顺反组（cistrome）：是指“一组反式作用因子在全基因组范围内的顺式作用靶点，也称为转录因子结合位点或组蛋白修饰的体内全基因组位置”。

#DAP-seq 与 CHIP-seq 的异同：CHIP-seq如上所述，是一种常见的用来发现转录因子结合位点的方法，但是，它有很强的局限性，例如：它很强地依赖于抗体的质量， 并且对发现低表达的蛋白有挑战。虽然ATAC-seq 可以更简单地来注释跨越许多生物体和细胞类型的全基因组调控元素。但是：如果没有对TF序列特异性的全面了解，所识别区域的靶向TFS就无法被轻易地验证。DAP-seq 可以用来揭示基因组范围内所有调控元件的特征。

植物和动物细胞中的许多信息都包含在指导生成蛋白质的“编码”DNA片段中。但研究人员日益认识到，基因组中其他区域具有的一些元件控制了细胞何时及如何生成这些蛋白。这些“非编码”DNA片段就是转录因子结合来控制邻近编码基因激活的位点。许多人类和动物模型研究表明，非编码改变对于认识遗传病症和癌症一类的疾病非常重要。能够阐明这些非编码区域在植物中的功能同样重要。”

非编码区（Non-coding region）是不能够转录为相应信使RNA，不能指导蛋白质合成（也就是不能编码蛋白质）的区段。非编码区位于编码区前后，同属于一个基因，控制基因的表达和强弱。