【方法篇】研究RNA互作结合蛋白（RBPs）的方法

最新推荐文章于 2022-04-14 06:16:07 发布

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本文链接：https://blog.csdn.net/weixin_42373414/article/details/112001744

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本文介绍了研究RNA结合蛋白（RBPs）的一种新方法——相互作用体捕获技术。该技术利用紫外线交联和Oligo(dT)捕获，能够在活细胞中识别活性RBPs，有效区分生理状态下的RNA-蛋白结合体。通过质谱鉴定，可以获取RBPs信息，并适用于不同生物状态的研究，如代谢、细胞周期等。尽管存在局限性，如无法检测未结合到PolyA+RNA的蛋白质，但这种方法为RBPs的动态响应研究提供了新途径。

摘要由CSDN通过智能技术生成

在这里插入图片描述
由于RNA结合蛋白（RBPs）显著的生物学功能，它们的表达情况和活性状态能否提供细胞系统的诸多信息。科学家们最近开发了一种新的技术手段，可称为相互作用体捕获手段，用于识别细胞中的活性RBPs。利用紫外线交联RBPs与RNA聚合物，并通过寡聚dT磁珠共价结合蛋白质。经过清洗后，再通过质谱检测结合蛋白。此实验方法大概耗时3天，并且该方法可以用在不同生物状态下，包括代谢、细胞周期、分化、发育或者对药物的反应等。

已经有许多方法用于研究mRNA相互作用蛋白，例如采用全基因组矩阵和荧光RNA探针对酵母RBPs进行系统的鉴定。当然采用固定化的RNA探针作为诱饵，在体外捕获特定的RBPs，然后在对其进行质谱检测。

然而，这些方法不能区分活细胞中发生的RBPs和非生理状态下的RNA-蛋白结合体。

因此有科学家开发了相互作用体捕获技术来克服这些限制，结合紫外线交联和Oligo（dT）捕获技术来获取活细胞中RBPs。

实验方法流程

为了在体内将RBPs和RNA共价偶联，单层细胞在254nm紫外光照射下，将Phe、Trp、Tyr、Cys、Lys等氨基酸与核苷酸发生交联，同时也应用了光活化核苷酸4-硫代嘌呤增强交联效果。这种核苷酸类似物被细胞吸收并用于合成新的RNA。在365nm的紫外光处理下可诱导蛋白质与RNA发生交联。细胞裂解之后，利用寡聚（dT）磁珠捕获聚腺苷酸RNA。经过清洗之后，与polyA+RNA结合的RBPs经过RNase