文献介绍
文献题目： Molecular and spatial signatures of mouse brain aging at single-cell resolution
研究团队： 庄小威（美国哈佛大学）、Catherine Dulac（美国哈佛大学）
发表时间： 2022-12-28
发表期刊： Cell
影响因子： 66.8（2022年）
DOI： 10.1016/j.cell.2022.12.010
摘要
大脑细胞的多样性和复杂组织阻碍了对其细胞和分子结构中与年龄相关的变化的系统表征，限制了我们理解衰老过程中其功能衰退机制的能力。在这里，作者利用空间分辨单细胞转录组学生成了额叶皮层和纹状体内大脑衰老的高分辨率细胞图谱，并量化了小鼠一生中这些区域主要细胞类型的基因表达和空间组织的变化。作者观察到非神经元细胞的细胞状态、基因表达和空间组织比神经元细胞有更显着的变化。作者的数据揭示了衰老过程中神经胶质细胞和免疫细胞激活的分子和空间特征，特别是在皮质下白质中富集，并确定了衰老和全身炎症挑战引起的细胞激活模式的相似性和显着差异。这些结果为与年龄相关的大脑衰退和炎症提供了重要的见解。
前言
哺乳动物的大脑在数年至数十年的时间内表现出显着的稳定性。由于大脑的再生能力有限，神经元必须在动物的整个一生中忠实地发挥其功能。然而，随着动物年龄的增长，神经元的这种长寿使得大脑对随着时间的推移而积累的损伤很敏感。这种神经元损伤，加上支持神经环路功能的非神经元细胞的年龄依赖性变化，被认为会导致大脑功能的衰退以及与衰老相关的神经退行性疾病患病率的增加。
大脑衰老的一个重要假说表明，与年龄和神经退行性变相关的神经元和突触功能的变化是大脑稳态环境破坏的结果。神经元由许多非神经元细胞支持，每个非神经元细胞维持着不同的状态。例如，少突胶质细胞使轴突有髓鞘并为神经元提供代谢支持；星形胶质细胞为神经元提供营养和离子支持并调节突触功能；小胶质细胞通过吞噬作用提供免疫监视、突触修剪和碎片清除。脑损伤、感染和神经退行性已被证明会触发这些常驻非神经元的炎症激活细胞类型并招募外周免疫细胞，从而对邻近神经元产生保护和有害作用。
最近对正常大脑衰老和神经退行性疾病的转录组学研究，以及针对星形胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞等特定非神经元细胞类型的研究，进一步强调了炎症激活在衰老相关衰退中的作用。特别是，在感染或损伤期间小胶质细胞和星形胶质细胞通常触发的反应状态也会在正常衰老过程中出现。
虽然这些研究表明，与年龄相关的大脑稳态的广泛破坏表现在多种细胞类型中，但它们也提出了许多问题。例如，不同细胞类型和细胞状态的分子特征和空间组织如何随着衰老而变化，以及这些变化与年龄诱导的炎症激活有何关系？激活的细胞在空间上如何分布，这种激活是否取决于环境因素和细胞间的通讯？年龄引起的炎症与全身炎症反应有何关系？回答这些问题具有挑战性，因为迄今为止，大脑巨大的细胞和分子复杂性阻碍了对动物一生中大脑结构变化的全面了解。
在这里，作者通过结合 MERFISH 和 snRNA-seq，使我们能够分析基因表达并识别小鼠额叶皮层和层中的细胞类型和状态，从而生成不同年龄的这些区域的空间分辨细胞图谱。该高分辨率细胞图谱揭示了神经元和非神经元细胞中与年龄相关的变化，并揭示了衰老过程中神经胶质细胞和免疫细胞激活的分子和空间特征。与脂多糖（LPS）诱导的变化进行比较，进一步揭示了衰老和全身炎症挑战诱导的非神经元细胞激活中先前未知的差异。
研究结果
1. 衰老大脑的空间解析单细胞转录组分析
作者进行了 snRNA-seq 测量，以探测两个不同年龄（产后 ~1 个月（4 周龄，幼年）和 ~21 个月（90 周龄，老年））小鼠额叶皮层和纹状体单个细胞的转录组图谱（Figures 1A and 1B）。这些大脑区域先前已被证明易患与年龄相关的神经退行性疾病。作者对每个年龄的两只雌性动物的 ~50,000 个细胞核进行了测序，并对通过质量控制的 ~80,000 个细胞进行了无监督聚类分析（Figures S1A–S1F）。
(A) 通过整合 snRNA-seq 和 MERFISH 分析对小鼠额叶皮层和纹状体进行分析。
(B) 小鼠整个生命周期中 snRNA-seq 和 MERFISH 测量的采样时间点。
(C) （左）来自 snRNA-seq 和 MERFISH 测量的所有时间点细胞的 UMAP 可视化。（右）通过 snRNA-seq（上）和 MERFISH（下）测量的单独的细胞 UMAP。细胞根据细胞类型分配进行着色。
(D) （左）与 (C) 相同，但细胞按年龄着色。仅显示幼年和老年时间点。（右）单独的 UMAP 图，显示为每个时间点的细胞密度覆盖所有三个年龄段的总细胞群（灰色）。
(E) 通过整合 snRNA-seq 和 MERFISH 聚类分析确定的分子定义的细胞类型。（上）snRNA-seq 和 MERFISH 中聚类之间的层次关系以及每个聚类的测量细胞数量的树状图。（中）不同细胞类型的示例标记基因的表达。（底部）每个类群中按年龄和形态划分的细胞分数，标准化为采样深度，以便每种条件下的相同代表性将具有相同的分数。
然后，作者根据 snRNA-seq 结果选择两组基因，通过 MERFISH 进行空间分辨单细胞转录组测量（Figure 1A）：（1）通过 snRNA-seq 确定的细胞类群之间差异表达的细胞类型标记和（2）与衰老相关的基因在各个细胞类群中的两个年龄之间差异表达。此外，作者选择了先前已知的定义主要神经元、胶质细胞和免疫细胞类型的细胞类型标记基因，以及先前报道的在衰老过程中在各种细胞类型中高度上调的基因。这些总共产生了 212 个细胞类型标记和 204 个衰老相关基因，作者通过两次背靠背 MERFISH 运行在相同的组织切片中对它们进行成像，每次运行都有 20-bit 条形码方案。
作者对三个不同年龄的小鼠的额叶皮层和纹状体中的这 416 个基因进行了成像：产后 ~1 个月（4 周龄，幼年）、~6 个月（24 周龄，年轻成年）、~21 个月（90 周龄，老年），每个年龄包含 3-5 只雌性动物（Figure 1B）。总共对 ~400,000 个细胞进行了成像并通过了质量控制。MERFISH 测量的单个基因的平均表达水平与 bulk RNA 测序的结果显示出良好的相关性，并且在生物重复之间具有高度的重复性（Figures S1G–S1I）。然后，作者使用 Harmony 算法共同嵌入 MERFISH 和 snRNA-seq 数据，包括所有测量的细胞，并对这两种数据模式进行整合聚类分析（Figures 1C and 1D），这与仅 snRNA-seq 数据的聚类结果表现出良好的一致性（Figure S1J）。整合分析总共产生了 43 种神经元和非神经元细胞类型（Figure 1E）。与之前对小鼠皮质和纹状体的 MERFISH 结果相比，细胞类群在这里以较低的粒度进行解剖，以捕获主要细胞类型与年龄相关的变化。神经元类群包括皮质中层特异性兴奋性神经元细胞类型 (ExN)（ExN-L2/3-IT、ExN-L5-IT、ExN-L5-ET、ExN-L5/6-NP、ExN-L6-IT、ExN-L6-CT），皮层中由典型抑制性神经元标记物（Sst、Pvalb、Lamp5、Vip）标记的抑制性神经元细胞类型（InN），皮层下嗅觉区域的兴奋性和抑制性神经元（ExN-Olf、InN-Olf)，Drd1+ (D1) 或 Drd2+ (D2) 中型多棘神经元 (MSN)、纹状体中的 Lhx6+ 或 Chat+ 中间神经元，以及空间分散的 Calb2+ 中间神经元。非神经元类群包括少突胶质细胞（Oligo）、少突胶质细胞前体细胞（OPCs）、星形胶质细胞（Astro）、室管膜细胞（Epen）、周细胞（Peri）、血管软脑膜细胞（VLMCs）、内皮细胞（Endo）、小胶质细胞（Micro)、巨噬细胞 (Macro) 和 T 细胞。snRNA-seq 和 MERFISH 数据共嵌入得很好，并且绝大多数细胞类群在两个数据集中都有很好的表现，每个数据集的类群之间的基因表达具有高度的一致性（Figures 1C, 1E, and S1K）。然而，作者注意到一些血管细胞类型（周细胞和内皮细胞）的 snRNA-seq 采样率很低（Figure 1E）。
不同的整合方法 (Allcools) 给出了类似的聚类结果（Figure S1L）。使用 snRNA-seq 和 MERFISH 细胞的平衡比例进行整合（其中 MERFISH 细胞被随机抽样到 ~80,000 个细胞）也给出了类似的聚类结果，但少数罕见的细胞类型除外，当 MERFISH 细胞减少（Figure S1M）。因此，作者将所有 MERFISH 细胞纳入整合中以进行进一步分析。
这种整合还使我们能够使用基因表达空间中邻近 snRNA-seq 细胞的转录组图谱（STAR Methods）来估算 MERFISH 测量的单个细胞的全基因组表达谱。作为验证，基因的估算空间分布与 MERFISH 直接测量的结果和 Allen 脑原位杂交图谱的结果（Figure S2）显示出良好的一致性，并且两种整合方法都产生了类似的估算结果（Figure S2）。
2. 与年龄相关的细胞状态和成分的变化
接下来，作者根据 MERFISH 数据分析了这些大脑区域的细胞组成和细胞状态在三个年龄段中如何变化。神经元类群的丰度没有表现出任何显着变化（Figure 2A）。相比之下，几种非神经元细胞类型在总体丰度和/或特定细胞类型内处于不同状态的细胞相对比例方面表现出显着的年龄依赖性变化（Figures 1E, 2A, and 2B）。特别是，随着动物年龄的增长，少突胶质细胞的丰度增加，而 OPC 的丰度大幅减少（Figure 2A）。在少突胶质细胞的三种状态中，Oligo-1 类群在幼年动物中占主导地位，在青年和老年动物中减少到几乎不存在，Oligo-2 在青年动物中占主导地位，在老年动物中丰度下降，而 Oligo-3 出现在老年动物中（Figure 2B）。与衰老相关的类群 Oligo-3 表现出 C4b（一种先天免疫系统的补体蛋白）和白细胞介素 33 (Il33)（一种参与炎症和先天免疫反应的细胞因子）的显着上调（Figure 2C），与之前的研究结果一致。这些结果表明少突胶质细胞最初成熟和增殖，可能是后期发育的结果，随后随着衰老，成熟少突胶质细胞发生炎症激活。小胶质细胞、内皮细胞和星形胶质细胞在不同细胞状态之间也表现出年龄依赖性的变化。例如，Micro-1 和 Endo-1 在幼年动物中富集，Micro-3 和 Endo-3 在老年动物中富集，Astro-2 在老年动物中丰度增加（Figure 2B）。这些与衰老相关的细胞状态表现出基因的上调（例如 Micro-3 中的 B2m 和 Trem2、Endo-3 中的 Xdh 以及 Astro-2 中的 Gfap 和 C4b）（Figure 2C），这些基因先前已被证明在小胶质细胞、内皮细胞、星形胶质细胞中富集，由炎症和/或衰老激活。与 T 细胞浸润到衰老大脑中一致，作者还观察到老年动物中 T 细胞的丰度大幅增加（Figure 2A），尽管由于在这种稀有细胞群中检测到的细胞数量较少，这种变化并未达到统计显着性。
(A) 三个年龄段不同主要细胞类型的密度（以 cells/mm2 为单位）。插图显示较低丰度细胞类型的放大视图。* 表示幼年和老年动物之间差异的 FDR-adjusted p-value < 0.05（独立样本 t-test）。数据以 mean±95% 置信区间表示。
(B) 不同年龄的少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和星形胶质细胞不同状态下的细胞比例。
(C) 示例基因在少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和星形胶质细胞不同状态下的表达小提琴图。
3. 与年龄相关的单个细胞类型和细胞状态的空间分布变化
MERFISH 数据进一步使我们能够绘制不同年龄单个细胞类型的空间组织图。为了可视化细胞的整体空间组织，作者根据细胞空间邻域的细胞组成对细胞进行分层聚类（STAR Methods），所得的空间聚类自然地将成像区域分割成已知的解剖结构，包括软脑膜、皮质层、胼胝体、纹状体、心室和皮质下嗅觉区域（Figure 3A）。正如预期的那样，不同的兴奋类群在皮质中采用层状分布，中型多棘神经元定位于纹状体（Figure 3A and 3B）；少突胶质细胞富集于胼胝体，VLMCs 和特定的周细胞类群 (Peri-2) 富集于软脑膜，室管膜细胞位于脑室周围，而 OPCs、星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞则基本均匀地分布在整个成像区域（Figures 3A and 3B）。
(A) （左）解剖区域的空间分割。（右）三个不同年龄的主要细胞类型的空间组织，按 cluster identity 着色。概述解剖区域的虚线是通过空间分割手动追踪的。Scale bar: 500 μm。
(B) 三个不同年龄的每个细胞 cluster 驻留在各个解剖区域的细胞比例。CC：胼胝体。 Olf：皮层下嗅觉区域。年轻动物中室管膜细胞丰度较低可能是由于分类为分子相似的星形胶质细胞或组织切片期间脑室表面的损失。
(C-F) 不同年龄的少突胶质细胞 (C)、星形胶质细胞 (D)、小胶质细胞 (E) 和内皮细胞 (F) clusters 的空间组织。Scale bar: 500 μm。
有趣的是，尽管不同年龄的神经元细胞类型的整体空间组织看起来相似（Figures 3A and 3B），但一些非神经元细胞随着年龄的增长表现出解剖富集的变化。例如，老年动物中出现的少突胶质细胞状态 (Oligo-3) 几乎只出现在胼胝体中，而 Oligo-1 和 Oligo-2 尽管在胼胝体中富集，但也可以在整个成像区域中找到（Figures 3C）。同样，与衰老相关的 Astro-2 类群主要出现在胼胝体中，而 Astro-1 在青年和老年动物的胼胝体中采用了互补分布（Figures 3D），这表明胼胝体中的星形胶质细胞状态随着动物的衰老发生了变化。另一方面，不同的小胶质细胞和内皮细胞类群或多或少均匀地分布在所有解剖区域（Figures 3E and 3F）。
此外，某些非神经元细胞类型表现出空间共定位的趋势。具体来说，血管细胞（内皮细胞、周细胞和 VLMCs）表现出彼此接近的趋势，并且这种趋势随着年龄的增长而增加，主要是在幼年和青年动物之间（Figure S3），这可能反映了血管结构在后期发育或血管结构的活动依赖性生长和/或重塑过程中的成熟。此外，巨噬细胞往往在血管细胞附近富集，这种趋势也随着年龄的增长而增加，但主要发生在青年动物和老年动物之间（Figure S3），可能是由于与衰老相关的炎症反应。小胶质细胞也观察到类似的趋势，尽管程度较小（Figure S3）。
4. 与年龄相关的单个细胞类型基因表达谱的变化
接下来，作者研究了单个细胞类型的全基因组表达谱如何随年龄变化。为此，作者根据 snRNA-seq 数据确定了幼年和老年动物在单个神经元和非神经元细胞类型中差异表达的基因数量（Figure 4A）。非神经元细胞类型往往比神经元表现出更多数量的年龄依赖性差异表达基因（Figure 4A）。许多年龄依赖性基因以细胞类型特异性的方式差异表达（Figure 4B）。GO 和 KEGG 富集分析表明，神经元中，特别是抑制性神经元中，随着年龄的增长上调的基因在与神经退行性疾病、氧化反应和线粒体功能相关的通路中富集，而非神经元细胞中随着年龄的增长而上调的基因往往与炎症和免疫反应相关（Figure 4C），这与之前观察到的衰老大脑中氧化应激和免疫途径的广泛上调一致。具体来说，年龄-非神经元细胞中上调的基因包括细胞因子（例如少突胶质细胞中的 Il33 和 Il18）、补体蛋白（例如星形胶质细胞和少突胶质细胞中的 C4b）以及参与干扰素反应的蛋白（例如室管膜细胞和周细胞中的 Ifit3 和 Ifitm3）（Figure 4B）。
(A) 单个细胞类群中幼年和老年动物之间差异表达 (DE) 基因的数量，其中红色和蓝色条分别显示随着年龄的增长而上调和下调的基因。DE 基因被定义为与年龄相关的 log(gene expression) change > 2（浅色条）或 > 2.5（深色条）且两个年龄之间 FDR-adjusted p-value < 0.05 的基因。
(B) 幼年和老年动物不同细胞类群中 DE 基因的 Z-scored log(gene expression) 与年龄相关的变化。
(C) GO biological process 术语和 KEGG 术语富集的 -log10(p-value)，DE 基因为两个年龄之间（幼年和老年）与年龄相关的 log(gene expression) change > 2 且 FDR-adjusted p-value < 0.05 的基因。对于每个主要细胞类别，仅列出 p-value < 0.05 的 top 10（或更少）GO 或 KEGG 术语。
(D) 三个不同年龄的 DE 基因示例的空间图，显示了每个基因在指定细胞类型中的表达。灰色点表示其他类型的所有其他细胞。Scale bar: 500 μm。
(E) 使用源自 Harmony 整合的推算基因表达数据，对每种主要细胞类型的 DE 基因数量作为空间位置的函数进行量化。考虑与年龄相关的 log(gene expression) change > 2 且 FDR-adjusted p-values < 0.05 的 DE 基因。点的大小表示区域内特定细胞类型的 DE 基因总数，点的颜色表示特定区域内所有区域差异表达的 DE 基因总数的分数，以相对比例绘制所有区域的最小分数到最大分数。
通过 MERFISH 测量的细胞的推算全基因组表达谱使我们能够确定不同年龄的所有基因的空间分布。许多年龄上调的基因表现出特定的空间模式（参见 Figure 4D 中的示例）。作者系统地量化了幼年和老年动物在各个解剖区域中每种主要细胞类型差异表达的基因数量，并观察到即使在同一类型的细胞中，随年龄上调或下调的基因总数的空间异质性（Figures 4E and S2E）。特别是，相对于其他解剖区域，少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞都在胼胝体白质中随年龄增长而表现出最多数量的差异表达基因。
为了进一步研究非神经元细胞类型中基因表达与年龄相关的变化，作者进行了基因-基因相关性分析，并鉴定了每种细胞类型中的基因组，这些基因的表达显示出彼此相关的变化，因此可能属于相同的基因调控网络。该分析揭示了少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞内表现出相关表达的许多基因组，此处称为基因模块（Figure S4）。许多这些基因模块的表达随着年龄的增长而上调或下调（Figure S4）。GO 或 KEGG 术语分析表明，其中许多模块与发育或免疫反应相关，通常捕获细胞类型特异性功能。这些结果表明存在特定的基因调控网络，其以细胞类型特异性和年龄依赖性的方式发挥作用。
值得注意的是，由于 snRNA-seq 测量仅在幼年和老年动物上进行，而不是在青年动物上进行，因此本节中描述的观察到的基因表达变化可能是由于发育迟缓或衰老造成的。事实上，两种类型的变化都被观察到。
5. 神经胶质细胞和免疫细胞的年龄依赖性激活
对于小胶质细胞和星形胶质细胞，作者观察到随着年龄的增长而高度上调的基因与之前报道的在这些细胞类型的激活（或“反应”）状态下上调的基因基本上重叠（例如，星形胶质细胞的 Gfap 和 C4b；小胶质细胞的 B2m 和 Lyz2）。在健康和患病的大脑中都观察到了这些激活的星形胶质细胞和小胶质细胞，通常对脑损伤、炎症或退行性做出反应。在老年啮齿动物和人类大脑中也有小胶质细胞和星形细胞激活的报道，但这种激活如何依赖于空间环境仍不清楚。
为了量化这些细胞类型的激活并确定激活细胞的空间分布，作者使用先前显示的激活细胞特异性基因（STAR Methods）对 MERFISH 成像的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活水平进行评分。星形胶质细胞和小胶质细胞的激活分数平均随着年龄的增长而增加（Figure 5A）。老年动物（Astro-2 和 Micro-3）中富集的星形胶质细胞和小胶质细胞类群比相同细胞类型的其他类群具有更高的激活分数（Figure 5B）。
(A) 三个不同年龄的所有星形胶质细胞和小胶质细胞的激活分数。激活分数定义为与炎症激活相关的细胞类型特异性基因子集相对于随机选择基因的背景的表达总和（STAR Methods）。
(B) 特定星形胶质细胞和小胶质细胞类群的激活分数。
(C) 三个不同年龄的星形胶质细胞和小胶质细胞激活分数的空间图。细胞根据激活分数着色。Scale bar: 500 μm。
(D) 三个年龄段不同解剖区域的星形胶质细胞和小胶质细胞的每个细胞激活分数。数据以箱线图的形式呈现，箱线显示中位数和四分位数范围，晶须显示最小值和最大值。
(E) 星形胶质细胞和小胶质细胞的平均激活分数作为与邻近少突胶质细胞、VLMCs 和内皮细胞在三个年龄段的距离的函数。从每条曲线中减去等于所有距离的平均激活分数的常数，并且不同曲线的这些常数显示在 STAR Methods 中。数据以 mean（实线）± SEM（阴影）表示。
(F) （左）胼胝体中每个小胶质细胞的激活分数与该小胶质细胞 30 μm 内少突胶质细胞的平均炎症分数的相关性。（中）与（左）相同，但针对星形胶质细胞和少突胶质细胞。（右）与（左）相同，但针对星形胶质细胞和小胶质细胞。给出了 Pearson 相关系数 R。
值得注意的是，星形胶质细胞和小胶质细胞在其激活模式中表现出不同的空间特征。星形胶质细胞的激活表现出更明显的空间异质性，胼胝体的激活水平最高，脑室和软脑膜附近的激活相对较强，但皮质的激活较弱（Figures 5C and 5D）。这种空间模式在幼年和青年动物中已经很明显，并且在老年动物中变得更加明显。另一方面，不同区域的小胶质细胞激活更加均匀，幼年和青年动物几乎没有任何空间异质性（Figures 5C and 5D）。随着动物年龄的增长，除了胼胝体和脑室附近的细胞表现出更高的激活水平外，不同区域的小胶质细胞激活或多或少均匀增加（Figures 5C and 5D）。
小胶质细胞和星形胶质细胞可能被血液中循环的促炎细胞因子和趋化因子激活，或者由脑浸润免疫细胞释放，并且蜘蛛观察到老年动物血管细胞附近的巨噬细胞富集（Figure S3）。这一观察结果促使作者进一步研究星形胶质细胞和小胶质细胞的激活水平是否取决于它们与将血液（例如内皮细胞）或脑脊液（例如 VLMCs）与大脑内部分开的血管细胞的距离。此外，由于作者观察到少突胶质细胞中涉及炎症反应和先天免疫信号传导的几个基因（Il18、Il33 和 C4b）上调（Figure 4B），因此作者还检查了星形胶质细胞和小胶质细胞激活对少突胶质细胞距离的依赖性。
这些依赖性在星形胶质细胞和小胶质细胞之间显着不同。在年轻和年老的动物中，星形胶质细胞的激活表现出对与 VLMCs 的接近程度的强烈依赖性，并且对与少突胶质细胞的接近程度的依赖性随着年龄的增长而大幅增加（Figure 5E）。另一方面，小胶质细胞并未表现出对血管细胞附近激活的实质性偏好，但衰老诱导的小胶质细胞激活显示出对其与少突胶质细胞的接近程度的强烈依赖性（Figure 5E）。此外，作者使用 Il33、Il18 和 C4b 的表达水平对少突胶质细胞的炎症水平进行评分，并观察到在胼胝体内，衰老诱导的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活水平与附近少突胶质细胞的炎症水平相关（Figure 5F），表明对少突胶质细胞接近程度的依赖性不仅仅是胼胝体中星形胶质细胞和小胶质细胞更强激活的反映，而且可能与少突胶质细胞随着衰老而产生的炎症反应有关。胼胝体中星形胶质细胞和小胶质细胞的激活水平也相互相关（Figure 5F）。
上述结果表明非神经元细胞激活有多种不同的机制，其中两种表现出强烈的空间依赖性：（1）分隔脑脊液和大脑的血管结构表面附近的星形胶质细胞的激活，可能是由脑脊液衍生的因素引起的，（2）胼胝体少突胶质细胞附近的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。只有第二种机制似乎是衰老特异性的。与两种不同激活机制的概念一致，软脑膜附近激活的星形胶质细胞的分子特征与胼胝体中的星形胶质细胞不同（Figure S5）。
6. 激活神经胶质细胞和免疫细胞以应对全身炎症挑战
星形胶质细胞和小胶质细胞随着年龄的增长而激活，让人想起大脑炎症，这提出了一个有趣的问题：这些与年龄相关的状态与全身炎症引起的状态相比如何。LPS 的外周给药广泛用于模拟与神经退行性疾病相关的脑炎症。尽管 LPS 本身被认为不会穿过血脑屏障，但 LPS 给药后外周免疫细胞全身释放细胞因子和趋化因子，可以广泛激活整个大脑的小胶质细胞和星形胶质细胞。
作者给三个年龄（出生后 ~1个月、~6个月、~21个月）的小鼠注射 LPS（Figure 6A），注射 LPS 后 24 小时对动物实施安乐死，并使用作者的细胞类型和衰老基因组进行 MERFISH 测量。~350,000 个细胞通过了质量控制分析，作者通过将 LPS 数据集与前面描述的正常大脑 MERFISH 数据集整合来对这些细胞进行分类，并 transferred 细胞类型注释而无需重新聚类（Figures 6B and S6A）。
(A) 实验方案。
(B) 通过 MERFISH 测量的按细胞类型（左）或年龄（右）着色的细胞 UMAP。
(C) 对于通过 MERFISH 测量的不同细胞类型，基因响应 LPS（洋红色）、年龄（绿色）、LPS 和年龄（黑色）而显着上调。仅当 Z-scored log(gene expression) change > 2 并且 FDR-adjusted p value <10−4 时，才认为基因显着上调。仅显示了至少一种细胞类型在至少一种条件下显着上调的基因。
(D) 随着年龄和 LPS 处理而上调的示例基因的空间图，显示了指定基因在切片内所有细胞中的表达。Scale bar: 500 μm。
(E) 三个不同年龄的激活小胶质细胞和星形胶质细胞的空间图，有和没有 LPS 治疗。细胞根据激活分数着色。Scale bar: 500 μm。
(F) 用 LPS 处理的幼年小鼠不同解剖区域的小胶质细胞和星形胶质细胞的每个细胞激活评分。箱线图的定义如 Figure 5D 所示。
(G) LPS 处理后幼年小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的激活分数与邻近少突胶质细胞、VMLC 和内皮细胞距离的函数关系，如 Figure 5E 所示。数据以 meean（实线）± SEM（阴影）表示。
(H) 在用 LPS 处理的幼年动物中，小胶质细胞和星形胶质细胞的激活评分与少突胶质细胞炎症评分的相关性，如 Figure 5F 所示。
作者观察到未经处理和 LPS 处理的小鼠在细胞类型的组成（Figures S6A–S6C）和整体空间组织（Figure S6D）方面具有高度相似性。然而，与未处理的动物相比，LPS 处理的动物在血管细胞附近表现出更高程度的巨噬细胞富集（Figure S6E），与正常衰老过程中观察到的情况类似（Figure S3）。
LPS 以细胞类型特异性的方式诱导基因表达的显着变化，并且一些上调的基因与显示与年龄相关的上调的基因重叠。为了量化这些影响，作者比较了 LPS 处理上调特定基因的程度以及 MERFISH 数据中的年龄（Figure 6C and S6F）。这些分析揭示了 LPS 引起的变化和年龄依赖性变化之间的相似性和差异。许多参与先天免疫反应的基因随着年龄的增长而上调，在对 LPS 的反应中也上调（Figures 6C and S6F）。然而，两种条件下上调的相对程度存在显着的数量差异。例如，C4b 随着年龄的增长而高度上调，并通过 LPS 处理进一步上调，这与之前使用 bulk RNA-seq 在星形胶质细胞中观察到的结果一致；Il33 随着年龄的增长而强烈上调，而 LPS 处理仅诱导该基因非常小的额外上调；Rsrp1 对 LPS 的反应更强烈上调（Figure 6D）。根据作者用来定义显着上调的标准，还有一部分免疫反应相关基因仅在两种条件之一下显着上调（Figure 6C）。
作者还比较了 LPS 处理下星形胶质细胞和小胶质细胞的激活模式以及衰老诱导的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活模式。LPS 增加了所有年龄段动物星形胶质细胞和小胶质细胞的活化（Figure 6E）。胼胝体以及软脑膜和脑室附近的星形胶质细胞优先被 LPS 激活，而小胶质细胞在所有区域基本上被 LPS 均匀激活（Figure 6E、6F 和 S6G）。此外，在幼年和青年动物中，LPS 对小胶质细胞的激活不依赖于与少突胶质细胞或 VLMCs 的接近程度，而星形胶质细胞的激活表现出对与 VLMCs 的接近程度的强烈依赖性和对与少突胶质细胞的接近程度的弱依赖性（Figure 6G、6H 和 S6H）。在老年动物中，LPS 处理的动物中小胶质细胞和星形胶质细胞激活对少突胶质细胞接近程度的依赖性比未处理的动物更弱（比较 Figure S6H 与 Figure 5E），可能是因为与年龄相关的激活的距离依赖性被掩盖了在一定程度上是由 LPS 的距离无关激活所致。作者注意到，虽然未经治疗的小鼠和经过 LPS 治疗的小鼠属于不同的动物队列，但队列间的差异远小于 +LPS 和 -LPS 条件之间观察到的差异（Figure S7）。
总而言之，这些结果显示了年龄和 LPS 诱导的非神经元细胞激活之间有趣的共性和差异：虽然这两种条件都会诱导星形胶质细胞的空间异质激活，并在脑脊液脑屏障附近富集，并且小胶质细胞分散激活，但衰老独特地诱导小胶质细胞活化，并可能相关增加胼胝体少突胶质细胞附近的星形胶质细胞活化。
讨论
对于大脑功能随年龄下降的原因提出了许多假设，从突触连接或生理学的变化到神经胶质细胞和免疫细胞的衰老以及循环炎症因子的作用。先前的转录组学研究揭示了大脑中细胞状态的广泛变化。特定细胞类型随年龄的增长，其中许多研究强调炎症增加是大脑衰老的一个关键方面。然而，要了解这些细胞如何变化可能会影响特定的大脑功能，为了深入了解与年龄相关的功能衰退的机制，表征大脑内这些变化的分子和细胞特征以及空间位置至关重要。
在这里，作者使用空间分辨单细胞转录组学来系统地揭示小鼠额叶皮层和纹状体脑细胞在动物一生中的分子特征和空间组织的变化。通过整合 snRNA-seq 和 MERFISH 数据，作者生成了衰老大脑的空间分辨细胞图谱，以及与每个细胞相关的全基因组表达谱。与神经元相比，作者观察到非神经元细胞中年龄引起的变化更为明显且性质不同，并且非神经元细胞中的这些变化表现出特定的空间模式。
在分子水平上，非神经元细胞中许多随着年龄的增长而上调的基因与先天免疫相关的炎症途径的激活有关，而神经元细胞群则表现出不同的转录变化，其中许多与神经退行性疾病、氧化应激和线粒体功能相关。免疫细胞和细胞因子等分泌因子广泛参与组织稳态的维持。因此，观察到的大脑内免疫细胞和神经胶质细胞中与炎症和先天免疫相关的基因上调可能表明组织稳态失调，这可能是组织稳态失调的一个迹象，广泛影响神经系统的功能。
虽然神经元的空间组织随着年龄的增长而基本稳定，但作者观察到非神经元细胞的细胞状态发生显着的空间依赖性变化，在衰老大脑的胼胝体中出现了特定的少突胶质细胞和星形胶质细胞状态。有趣的是，衰老过程中小胶质细胞和星形胶质细胞的炎症激活表现出不同的空间模式：两种细胞类型在胼胝体中表现出最强的激活，该位置也显示出少突胶质细胞的强烈炎症变化，而星形胶质细胞在软脑膜附近也表现出增强的激活。总体而言，星形胶质细胞的激活似乎比小胶质细胞的激活更具空间异质性。总而言之，这些结果强调胼胝体白质是大脑中与年龄相关的炎症变化的热点。
先前对人类的 MRI 研究表明，前额叶白质非常容易受到与年龄相关的体积减少的影响，并且白质变化的程度与认知能力下降有关。对非人类灵长类动物大脑衰老的电子显微镜研究揭示了白质的重大变化，特别是髓鞘的破坏。白质小胶质细胞反应性也与衰老和疾病有关。扩展这些发现，作者的结果表明少突胶质细胞和有髓鞘轴突的变化，及其在白质中相关的小胶质细胞和星形细胞反应性，可能是与年龄相关的认知缺陷的重要因素。作者观察到胼胝体中小胶质细胞和星形胶质细胞的激活水平彼此相关，并且与由 IL33 等细胞因子标记的少突胶质细胞的炎症水平相关，进一步表明了这种炎症激活背后的潜在分子机制。在一种情况下，衰老少突胶质细胞中促炎细胞因子 Il33 的表达升高可能会通过 Il33 受体激活小胶质细胞，已知该受体在小胶质细胞中表达。在第二种可能相关的模型中，过度的髓磷脂降解可诱导吞噬作用的激活髓鞘碎片超载的小胶质细胞。在这两种情况下，激活的小胶质细胞可以通过分泌促炎细胞因子和补体蛋白反过来激活星形胶质细胞。激活的星形胶质细胞和小胶质细胞可能反过来加剧少突胶质细胞和髓磷脂变性。
作者的结果进一步表明，衰老诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞活化与全身炎症挑战诱导的活化既相似又存在显着差异。一方面，许多相同的基因在急性 LPS 治疗和衰老过程中均上调，这与之前观察到的大脑对衰老和 LPS 治疗的类似反应在促炎细胞因子和这些细胞类型激活状态标记物的大量表达方面一致。另一方面，作者还观察到衰老和 LPS 处理引起的细胞状态变化在基因表达和空间模式方面的差异。特别是，在衰老大脑中独特地观察到与胼胝体白质中少突胶质细胞炎症相关的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。识别这些共性和差异背后的分子机制需要对大脑中特定细胞因子和其他信号通路的作用进行进一步的机制研究。事实上，这两个过程可能会交叉：大脑内固有的与衰老相关的退行性过程会局部破坏组织稳态，可能使细胞进入促炎症状态，然后系统因素可能会加剧这种状态。
非神经元细胞稳态破坏对神经环路的功能后果仍有待研究。作者观察到的许多在衰老过程中上调的基因（例如白细胞介素和补体蛋白）已被证明在发育过程中通过神经元和非神经元细胞之间的相互作用在调节神经环路组织和功能中发挥着至关重要的作用。作者的衰老大脑细胞图谱可以促进未来的研究，旨在确定这些分子随年龄的空间局部上调是否会反过来导致神经环路功能的局部破坏。将小鼠的这些研究与人类在多种条件下（正常衰老、急性脑损伤以及神经退行性疾病）的空间转录组测量相结合，可能会揭示非神经元细胞的炎症激活如何导致与高龄和疾病相关的神经元和环路水平的认知障碍。
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