BUSCO 评估基因组组装质量和完整性工具使用

BUSCO是Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs（通用单拷贝同源基因基准）的缩写，基于基因进化（有参比对）评估基因组组装和注释完整性的开源python软件。其对接结果的评估与 quast 不同，它并不追求基因组拼接的长度，而关注的是是否将一些单拷贝直系同源基因拼接出来。在相近的物种之间总有一些保守的序列，而 BUSCO 就是使用这些保守序列与组装的结果进行比对，鉴定组装的结果是否包含这些序列，包含单条、多条还是部分或者不包含等等情况来给出结果。

BUSCO 评估的原理:

软件根据 OrthoDB 数据库，构建了几个大的进化分支的单拷贝基因集。使用hmmsearch进行比对，将拼接结果预测得到的基因集与该基因集进行比较，根据比对上的比例、完整性，来评价拼接结果的准确性和完整性。也就是比对上已知基因集的基因越多，说明拼接的结果越好。

使用hmmsearch进行比对时：

根据得分判断单拷贝蛋白质是否存在：

expected score’ cut-off is defined as 90% of the minimum bitscore from an HMM  search of all of a BUSCO group’s members against its own HMM profile

根据长度判断是否完整:

这里长度根据该单拷贝基因家族的长度分布，query的长度必须落在平均长度的±2σ 之间即为完整，当BUSCO中的蛋白在query蛋白集中比对到多个，则被认为是多拷贝。                                                             BUSCO流程框架图

一：软件安装：

下载链接：
https://gitlab.com/ezlab/busco/
https://busco.ezlab.org/
https://busco.ezlab.org/busco_userguide.html
其依赖比较多，还需要配置Python环境，建议用Conda安装。
Conda安装命令
conda create -n busco -c conda-forge -c bioconda busco=5.3.2

下图是安装过程：

二．下载数据库文件

软件安装完毕之后，就开始下载数据库文件了，根据组装的物种来选择对应的数据库文件。以节肢动物数据库下载为例

https://busco-data.ezlab.org/v5/data/lineages/

https://busco-data.ezlab.org/v5/data/lineages/arthropoda_odb10.2020-09-10.tar.gz

顺便下载了真核生物的、后生生物的、蛛形纲的。

https://busco-data.ezlab.org/v5/data/lineages/eukaryota_odb10.2020-09-10.tar.gz

https://busco-data.ezlab.org/v5/data/lineages/metazoa_odb10.2021-02-24.tar.gz

https://busco-data.ezlab.org/v5/data/lineages/arachnida_odb10.2020-08-05.tar.gz

tar -zxvf arthropoda_odb10.2020-09-10.tar.gz

cd arthropoda_odb10/

三．参数设置

公司给建议：

busco --config config.ini -i genome.fa -r -o sample_name --out_path ./ -l arthropoda_odb10 -m geno -c 32 -f

我的运行命令：

busco -i /path/to/canu_removedup.fa -r -o canu_remdup --out_path /path/to/busco --lineage_dataset /path/to/arthropoda_odb10 -m geno -c 32 -f --offline

这行命令依赖metaeuk寻找可能的编码区，还可以通过augustus进行：

busco -i /path/to/canu_removedup.fa -r -o canu_remdup_augus --out_path / path/to /busco --lineage_dataset / path/to /arthropoda_odb10 -m geno -c 32 -f --offline --augustus

–augustus: Use augustus gene predictor for eukaryote runs

-i or --in 指定输入文件，核苷酸序列或者蛋白的fasta序列文件，v5.1.0，输入文件可以指定为目录文件，对文件夹内的fasta进行批量处理；
-o or --out 指定输出结果目录；
-m or --mode:运行模式，可选择genome, proteins, transcriptome；
-c N, --cpu N: Specify the number (N=integer) of threads/cores to use.
-l or --lineage_dataset:指定输入数据库的地址
--offline ：配合-l 指定下载的数据库时使用，否则会报错找不到数据库
-f ，--force：Force rewriting of existing files. Must be used when output files with the provided name already exist.

数据库名字例如：bacteria_odb10, 或者 a path i.e. ./bacteria_odb10 or /home/user/bacteria_odb10.

Busco中建议使用前一个示例引入数据库文件，Busco会自动下载引入的数据库文件；后者示例中，从指定的路径文件中寻找数据库文件。如果使用自动的lineage,Lineage会被忽略；

Lineage can be ignored if running automated lineage selection.

config files：

In the config/ subfolder of the cloned repository, a config.ini template is provided. In this file, you may declare the paths to all third party components matching what is on your machine. To activate this config file, set the environment variable BUSCO_CONFIG_FILE with the path to the file, as follows:

export BUSCO_CONFIG_FILE=“/path/to/myconfig.ini”

Alternatively you may pass the path to your config file by using the --config /path/to/config.ini command line option. This is useful for switching between configurations or manage parameters for each run in a dedicated file.

四：结果

运行了4h~,我展示了一下某物种参考基因组的busco结果：

最主要的结果在short_summary…2018.txt中，

C:多少个BUSCO测试基因被覆盖，C=S+D;

S:多少个基因经过比对发现是单拷贝；

D:多少个基因经过比对发现包含多拷贝；

F:多少个基因经过比对覆盖不完全，只是部分比对上；

M:没有得到比对结果的基因数；

Total:总共测试的基因条目数，Total=C+F+M。

此外，还可以进行多物种的busco结果的比较，这个就先不展示了。

五．参考：

https://www.sohu.com/a/213046854_464200

https://busco.ezlab.org/

https://www.jianshu.com/p/0ed311feaffa

文献引用：

The novelties introduced in BUSCO v4 and v5 and the new BUSCO datasets (*_odb10) are described here.If you’ve used these versions the correct citation would be:

Mosè Manni, Matthew R Berkeley, Mathieu Seppey, Felipe A Simão, Evgeny M Zdobnov, BUSCO Update: Novel and Streamlined Workflows along with Broader and Deeper Phylogenetic Coverage for Scoring of Eukaryotic, Prokaryotic, and Viral Genomes. Molecular Biology and Evolution, Volume 38, Issue 10, October 2021, Pages 4647–4654

Additional protocols and applications are described in: Manni, M., Berkeley, M. R., Seppey, M., & Zdobnov, E. M. (2021). BUSCO: Assessing genomic data quality and beyond. Current Protocols, 1, e323. doi: 10.1002/cpz1.323