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口腔常见微生物的培养方法
Culture Method of Oral Common microorganisms
张翼飞1, #，卢洪叶2, #，张倩1，陈智滨2, *，陈峰1, *
1北京大学口腔医学院中心实验室微生物平台，北京；2北京大学口腔医学院牙周科，北京
*通讯作者邮箱：chenfeng2011@hsc.pku.edu.cn；kqyehui21@bjmu.edu.cn
#共同第一作者/同等贡献
摘要：口腔微生物实验常见菌株包括：链球菌、乳酸杆菌、白色念珠菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌以及伴放线聚集杆菌等。前三种菌属的培养方法分别是：口腔链球菌在37 °C条件下，静置培养在BHI培养基中；口腔乳杆菌属于37 °C厌氧条件下，静置培养于MRS培养基中；口腔白色念珠菌于37 °C，150 r/min摇瓶培养于沙氏培养基或静置培养于沙堡弱培养基平皿。牙周可疑致病菌包括牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌以，必须用血培养基加特殊辅助因子厌氧培养。而伴放线聚集杆菌是微需氧菌，不需要厌氧培养。
关键词：口腔链球菌，口腔乳杆菌，口腔念珠菌，牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌，中间普氏菌，伴放线放线杆菌，培养条件
材料与试剂
1.脑心浸液肉汤培养基 (BHI) (品牌：Oxiod；产地：美国；catalog number: CM1135)
2.脑心浸液琼脂培养基 (品牌：AOBOX；产地：中国；catalog number: 02-349)
3.MRS肉汤培养基 (品牌：Oxiod；产地：美国；catalog number: CM0359B)
4.MRS琼脂培养基 (品牌：Oxiod；产地：美国；catalog number: CM0359B)
5.液体沙氏培养基 (品牌：海博；产地：中国；catalog number: HB0379)
6.沙氏琼脂培养基 (品牌：海博；产地：中国；catalog number: HB0235)
7.琼脂 (品牌：Biotopped；产地：日本；catalog number: A6190)
8.无菌脱纤维羊血 (品牌：Solarbio；产地：中国；catalog number: TX0030)
9.氯化血红素-维生素K1 (品牌：PYG；产地：日本；catalog number: 21301)
仪器设备
1.二氧化碳孵箱 (品牌：Thermo Fisher Scientific；产地：美国；catalog number: ab12345)
2.电热恒温培养箱 (品牌：上海一恒；产地：中国；catalog number: DHP-9052)
3.厌氧培养罐 (品牌：尤德生物；产地：中国；catalog number: UT706)
4.厌氧产气袋 (品牌：梅里埃；产地：法国；catalog number: 45534)
5.恒温摇床 (品牌：RADOBIO；产地：中国；catalog number: Stab S2)
6.立式压力蒸汽灭菌器 (品牌：上海申安；产地：中国；catalog number: LDZX-30KBS)
实验步骤
一、口腔细菌的培养
1.口腔链球菌（Streptococcus），包括血链球菌（Streptococcus sanguis）、变异链球菌（Streptococcus mutans）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、轻链球菌（Streptococcus mitior）等的培养
该方法已被广泛应用于多个研究(付洪，2013；朱立芬&王冰，2017；Sun et al., 2019)，也在我们实验室得到了验证(任雯等，2014)。
1.1培养基的选择：选用脑心浸液肉汤 (brain heart infusion, BHI broth) 培养基和BHI琼脂培养基。
1.2菌株的活化与复壮：取20 μl冻存于甘油管中的保种液，接种于1 ml的BHI肉汤培养基中，于5%二氧化碳孵箱 (或厌氧培养罐) 中，37 °C下静置培养24 h，活化菌株。将过夜培养的口腔链球菌采用三区划线的方式转接于BHI琼脂培养基上，37 °C培养48 h，以此连续活化3次。
1.3菌株扩大培养：从培养皿上挑取单菌落，接种到1 ml的BHI肉汤培养基中，放置到5%二氧化碳孵箱中 (或厌氧培养罐中) , 37 °C下静置培养12 h。
1.4菌种的保存：常采用冷冻保存法或液氮保存法 (周学东等，2009) 。
2.口腔乳酸杆菌（Lactobacillus），包括嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）等的培养。
该方法已被广泛应用于多个研究(Wright and Klaenhammer, 1981)，也在我们实验室得到了验证(Zhang et al., 2014)。
2.1培养基的选择：通常选用De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 琼脂培养基及MRS肉汤培养基 (Ratchapin et al., 2016; Zinatizadeh et al., 2018; Lin et al., 2020) 。
2.2菌株的活化与复壮：取20 μl冻存于甘油管中的保种液，接种于1 ml的MRS肉汤培养基中，于37 °C条件下静置培养24 h，活化菌株 (Chen et al., 2017; Yue et al., 2020) 。将过夜培养的乳酸杆菌采用三区划线的方式转接于MRS琼脂培养基上，37 °C培养48 h，以此连续活化3次。
2.3菌株扩大培养：从培养皿上挑取单菌落，接种到1 ml的MRS肉汤培养基中，放置到5%二氧化碳孵箱中 (或厌氧培养罐中) , 37 °C下培养18 h。
2.4菌种的保存：常用的有冷冻保存法或冷冻干燥法 (周学东等，2009) 。
3.常见牙周致病菌的培养
主要牙周致病菌包括：牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis) 、具核梭杆菌 (Fusobacteria nucleatum) 、中间普氏菌 (Prevotella intermedia) 以及伴放线聚集杆菌 (Aggregatibacter Actinomycetemcomitans) 等。该方法已被广泛应用于多个研究 (Moslemi et al., 2015; Lu et al., 2009)，也在我们实验室得到了验证(Li et al., 2019)。
3.1培养基的选择：通常选用BHI血肉汤培养基和BHI血琼脂平板培养基 (用于厌氧菌培养，最好新鲜配置，避免放置时间过长而渗入大量氧气) 。
3.2菌种复苏：从吸取20 μl保种液，接种到BHI血琼脂平板培养基上，放入厌氧培养袋中，并将袋置入5%二氧化碳孵箱 (或厌氧培养罐中) , 37 °C下培养5-7 d。
3.3菌株扩大培养：从培养皿上挑取1-3个单菌落，接种到2 ml的BHI血肉汤培养基中，放到厌氧产氧袋中，将袋置入37 °C的空气孵箱中，培养48 h。
3.4菌种的保存：常用的有冷冻保存法。收集生长良好的琼脂表面菌落混悬于无菌保护剂 (如甘油、脱脂纤维蛋白羊/兔血、加葡萄糖的血清、脱脂牛乳中，制成混悬液分装于无菌安瓿中，立即放入-20~-70 °C低温冰箱中 (周学东等，2009) 。菌种保存的方法还有冷冻干燥法、甘油保存法等。
注：另外一个重要的牙周致病菌伴放线聚集杆菌是微需氧菌，不需要厌氧产气袋，其他操作步骤同上。
二、口腔白色念珠菌（Candida albicans）的培养
该方法已被广泛应用于多个研究(Khan et al., 2013; Gamarra et al., 2015)，也在我们实验室得到了验证(Hu et al., 2019)。
1.培养基的选择：通常选用沙氏 (Sabouraud) 琼脂培养基和沙氏液体培养基。
2.菌种复苏：吸取20 μl甘油保种液，接种到沙氏琼脂培养板上，放置到5%二氧化碳孵箱中，37 °C下培养48 h (Jacouton et al., 2017) 。
3.菌株扩大培养：从培养皿上挑取单菌落，接种到1 ml的沙氏液体培养基中，37 °C下150 r/min摇瓶培养48 h (Yue et al., 2020) 。
三、培养基的配制
注：培养基的配制及灭菌需要参考产品包装上的说明，不同品牌的同一产品配制比例及灭菌温度和时间可能不一样。
1.BHI肉汤培养基：称取3.7 g BHI肉汤干粉，溶于100 ml蒸馏水中，121 °C高压灭菌15分钟，待冷却至常温，备用。
2.BHI血肉汤培养基：将3.7 g BHI 肉汤干粉，溶于100 ml蒸馏水中。121 °C高压灭菌15分钟，降至50 °C。以1:10和1:100的浓度加入无菌脱纤维羊血和氯化血红素-维生素K，震荡混合均匀。冷却至常温，放入4 °C冰箱，避光保存，备用。
3.BHI琼脂培养基：称取5.2 g BHI琼脂干粉，溶于100 ml蒸馏水中，121 °C高压灭菌15分钟，待温度降至50度左右倒入无菌培养皿中，待凝固，备用。
4.BHI血琼脂平板培养基：将BHI粉、琼脂粉与蒸馏水以3.7 g：2 g：100 ml的比例混合。121 °C高压灭菌15分钟，降至50 °C。以1:10和1:100的浓度加入无菌脱纤维羊血和氯化血红素-维生素K，震荡混合均匀。倾注于无菌平板上，待其冷却凝固，放入4 °C冰箱，避光保存，备用。
5.MRS肉汤培养基：称取5.2 g MRS肉汤干粉，溶于100 ml蒸馏水中，115 °C高压灭菌20分钟，待冷却至常温，备用。
6.MRS琼脂培养基：称取6.62 g MRS琼脂粉，溶于100 ml蒸馏水中，115 °C高压灭菌20分钟，待温度降至50度左右倒入无菌培养皿中，待凝固，备用。
7.沙氏液体培养基：称取5 g液体沙氏培养基干粉，溶于100 ml蒸馏水中，115 °C高压灭菌20分钟，待冷却至常温，备用。
8.沙氏固体培养基：称取6.5 g液体沙氏琼脂培养基干粉，溶于100 ml蒸馏水中，115 °C高压灭菌20分钟，待温度降至50度左右倒入无菌培养皿中，待凝固，备用。
参考文献
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