Nature Microbiology：肠道菌群如何划分肠型

题目：基于肠道菌群组成的“肠型”如何定义？

认识肠道菌群领域的29位大佬，从熟悉他们的名字和单位开始。

作者：Paul I. Costea 1, Falk Hildebrand 1,2,3, Arumugam Manimozhiyan 4, Fredrik Bäckhed 5,6, Martin J. Blaser 7, Frederic D. Bushman 8, Willem M. de Vos 9,10, S. Dusko Ehrlich 11,12, Claire M. Fraser 13, Masahira Hattori 14, Curtis Huttenhower 15, Ian B. Jeffery 16, Dan Knights 17,18, James D. Lewis 19, Ruth E. Ley 20, Howard Ochman 21, Paul W. O’Toole 16, Christopher Quince 22,
David A. Relman 23,24,25, Fergus Shanahan 16, Shinichi Sunagawa 1,26, 王俊 5,27,28,29,30,
George M. Weinstock 31, Gary D. Wu 32, Georg Zeller 1, 赵立平 33, Jeroen Raes 2,3,34*,
Rob Knight 35,36,37,38* and Peer Bork 1,39,40*

1. 德国，海德堡，欧洲分子生物学实验室(EMBL)
2. 比利时，VIB微生物中心
3. 比利时，布鲁塞尔大学，微生物实验室
4. 丹麦，哥本哈根大学，卫生和医学科学系，诺和诺德基金会基础代谢研究中心
5. 瑞典，哥德堡大学，萨尔格学院，医学研究所，分子与临床医学系，瓦伦堡实验室
6. 丹麦，哥本哈根大学，卫生科学系，受体与肠内分泌代谢部，诺和诺德基金会基础代谢研究中心
7. 美国，纽约大学，朗格尼医学中心
8. 美国，费城，宾夕法尼亚大学医学院，微生物系
9. 芬兰，赫尔辛基大学，细菌与免疫系
10. 荷兰，瓦赫宁根大学，微生物实验室
11. 法国，朱昂萨斯，国家农业研究院，MetaGenoPolis (MGP)计划
12. 英国，伦敦，Guy医院，牙科中心办公室，宿主与微生物组互作中心；伦敦国王学院
13. 美国，巴尔的摩，马里兰大学医学院，基因组研究所
14. 日本，东京，早稲田大学，高等科学与工程研究生院
15. 美国，波士顿，哈佛公共卫生学院，生物统计系
16. 爱尔兰，科克郡，科克大学，APC微生物组研究所
17. 美国，明尼苏达，圣保罗，明尼苏达大学，生物技术研究所
18. 美国，明尼阿波里斯市，明尼苏达大学，计算机科学与工程系
19. 美国，费城，宾夕法尼亚大学医学院，临床流行病与生物统计中心
20. 德国，图宾根，MPI微生物组科学部
21. 美国，德州，奥斯丁，德州大学综合生物学系
22. 英国，考文垂，华威大学，华威医学院
23. 美国，加州，斯坦福大学，微生物与免疫系
24. 美国，加州，斯坦福大学，医学部
25. 瑞士，苏黎世联邦理工学院，微生物所，生物部
26. 丹麦，哥本哈根大学，生物系
27. 沙特，吉达，阿卜杜勒阿齐兹国王大学，遗传异常研究中心
28. 中国，澳门，凼仔岛，澳门科技大学中医药学院
29. 香港，薄扶林，港大，医学、医药生物技术国家重点实验室
30. 美国，法明顿，杰克逊基因组医学实验室
31. 美国，费城，宾夕法尼亚大学医学院，肠胃病学系
32. 中国，上海交通大学，上海系统生物医学中心，系统生物医学教育部重点实验室
33. 比利时，鲁汶大学，微生物与免疫系
34. 美国，博尔德，科罗拉多大学，计算机科学系
35. 美国，博尔德，科罗拉多大学，生物前沿研究所
36. 美国，博尔德，科罗拉多大学，化学与生化系
37. 美国，博尔德，科罗拉多大学，霍华德·休斯医学研究所
38. 德国，柏林，Max DelbrüCK分子医学中心
39. 德国，海德堡，分子医学伙伴单位

来自EMBL的Paul I. Costea和Falk Hildebrand为共同第一作者。科罗拉多大学的Rob Knight和EMBL的Peer Bork为共同通讯作者。

摘要

群体分型(分层/层化，stratification)是一种有助于更好的理解人类身心健康等复杂生物学问题的有效方法。将这种方法应用于肠道微生物中，可以将不同的群落组成定义为肠型，对科学研究产生了积极的影响，但也引发了巨大的争议。我们基于原始工作发表以来积累的大量数据进行重新分析，重新审视肠型这一概念，讨论区分微生物组结构的不同方法，并将这些概念应用于功能、生态和医学领域内。由于肠型在描述肠道微生物群落结构时非常有效，且可能用于指导临床实践，因此我们呼吁合理的使用这一概念并希望协调出现的不同观点。

正文

人体内定殖着数万亿的有益于身心健康的微生物，通常不同的微生物群落定殖在不同的人体部位 (图1)。研究表明不同人同一部位的微生物群落组成差异很大，同一个人的不同部位的微生物群落组成也显著不同 (图1)。

图1. 健康人身体不同位置微生物组在属水平明显分开

人体内最复杂的定殖环境当属肠道，据估计大约有150克的微生物定殖于此，包括各种各样的细菌和古菌，其中以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主要类群。个体间微生物群落的差异已经被广泛证明，例如美国的人类微生物组计划(HMP)，欧洲的肠道宏基因组计划(MetaHIT)和众多其他的肠道菌群研究，都证明此现象的存在。此外，研究还表明肠道微生物群落变化表现出不同的演替阶段，可分为：婴幼儿快速变化期，成人稳定期和老年退化期。
目前，在大人群和跨地理研究中，还很难简单的描述如此复杂的生物现象，部分原因是有些类群在不同个体间表现为单峰(正态分布)，而另外一些类群又表现出双峰或者更复杂的分布模式(图2a)。
考虑到肠道系统的重要性和复杂性，确定微生物群落组成的结构模式及其背后的组装机制是非常必要的，这些能够帮助我们更好的了解人体的健康和疾病状态。基于群落组成结构的分类方法将加强基于微生物的疾病诊断、治疗或预防，并在营养、微生物和药物干预方面对个性化治疗产生影响。这种基于微生物组成的模式可以被用来对人群进行分类，类似于癌症研究中常用的分子亚型分类，例如，在临床上，基于基因表达的模式与乳腺癌子类是相关的。然而，我们也应注意到，在其他情况下，如结直肠癌，这种分类方式的有效性仍不清楚，值得注意的是分子水平的分型并不是在所有情况下都适用。

图2. 人类肠道微生物群落组成的分型。
a, 人类肠道中普遍微生物属的丰度分布非常复杂。基于278个MetaHIT样品中肠型主要指示物种多度数据分析得到的beta多样性的理论分布模式（左）和实际分布模式（中）和肠型空间分布（右）。在3个大数据集中，当拟杆菌（Bacteroides）丰度分布接近于对数正态分布时，普氏菌属（Prevotella）则表现为双峰分布，暗示两种分布的混合型可以更好的解释观察值，这种现象可能来自于两种完全不同的生态过程，一个对应群落内优势物种的状态，另一个对应相对稀有物种的状态。
b, 有关肠型研究的地理分布（附表1）；报道的肠型数量在图中用颜色标示，点代表研究中样品来自于哪个国家。连线代表样品属于同一个研究项目。大部分研究来自西方国家，可能对结果造成偏差，从而忽略其他人群中的肠道菌群的变异。
c, 基于多元正态分布模拟微生物组成的示意图，存在三个高密度主峰，每一种代表一种肠型，峰图可以更清晰的展示肠型的概念。此图可以通过修改不同的参数来对图中空间分割，从而在覆盖不同人群样品范围内（由交叉平面表示）产生不同的集群数量（2个或者3个），
d, 同一群体基于不同分类方法定义的肠型。最上面的图层将空间分割为3个离散的空间。

稳定的微生物群落变异模式已经在成人肠道研究中被证明，例如：主要类群如拟杆菌(Bacteroides)和普氏菌属(Prevotella)的比例在成人肠道内是稳定的(图2a和附图1)。当微生物群落组成的变异被划分成集群/组(cluster)后，它们可以被称作为肠型(enterotypes)，并且可以作为一种非常有效的区分人体肠道微生物的方法。后来，此研究方法被应用于其他生态系统如阴道和身体其他部位的微生物群落的分类。然而，由于肠道微生物聚类方法的差异，自肠型的概念提出以来，关于肠型的数量和存在其他不同类型的讨论从未间断。

在本文中，我们采用来自三个大陆的宏基因组大数据（包括美国的人类微生物组计划(HMP)，欧洲的肠道宏基因组计划(MetaHIT)和中国二型糖尿病研究数据）来评估肠道微生物群落组成的变化并验证不同的假说。我们通过精细的元分析，提出了一种改进的肠型概念，目的是协调出现的不同观点。研究结果展示了聚类和其他分层分析方法的优点和缺点。我们发现肠道微生物群落是结构化的，虽然在统计学上没有强有力的支持，但聚类的方法还是可以为微生物组数据提供有效的解释。另外，由于群落水平的分层分析只解释了微生物群落变化的某些方面，因此，这种分析方法并不能替代其他分析方法对群落变异的解释。

肠道微生物群落组成模式的稳定性

通过研究上面提到的3个大数据集，我们发现在肠道菌群中，属水平的群落组成可以将样品很好的分组(附图2)，这一结果与肠型研究的原始文献的结果一致。也就是说，某些相对丰富的微生物出现频率要高于其他物种。这些现象都可以通过计算样本之间的距离、研究产生的分组，以及通过直接观察一些肠道微生物类群丰度的复杂分布来验证(图2)。这种微生物群落结构对特定微生物的偏好是适度的，导致在偏好某种微生物的集群周围形成更高的样品密度，但是我们也可以发现有许多样品处于不同的分组之间。这种现象的出现导致我们很难用精确的数学的方法来描述这些偏好某种微生物的微生物群落，也很难确定这类高度密集群的数量，这就促使人们采用另一种方式来描述这部分区域，即梯度结构(gradients，连续不可分型)。然而，我们要清楚在群落变化研究中什么是最重要的？描述这些局部最优的群落组成，是为了更好的理解生态限制和群落特性对群落结构的影响机制。

2011年，采用三种测序技术(Illumina、454和Sanger)，对来自三个国家(丹麦、西班牙和美国)的人类粪便样本中的16S rRNA基因进行测序分析，得出肠道微生物存在三种肠型的结果。肠型被描述为“在群落组成的多维尺空间中样品密集的集群”，并且其不会受年龄、性别、文化背景和地理位置的影响。对每一种肠型的特性研究，发现共存的微生物网络中心存在一种指示/驱动类群，即这一类微生物与给定的肠型最相关。例如：肠型1，又可以表示为ET B，Bacteroides(拟杆菌)是其最好的指示类群；肠型2，又可以表示为ET P，是由Prevotella(普氏菌)驱动的，它的丰度通常与拟杆菌的丰度成反比；肠型3，又可以表示为ET F，是通过Firmicutes(厚壁菌)占比高低来区分的，其中最主要的类群为Ruminococcus(瘤胃球菌)。 以上所有分析都是基于属水平分类进行的，因为属水平可以更好的反映生态位变化。尽管有一些属表现出功能异质性，如链球菌(streptococci)，它既包含常见的共生菌和致死性病原体，又包含可以用于食物发酵的类群，但通常属水平的分析还是比较可靠的。这种方法虽然可以促进个体间功能差异在临床中的应用，但是我们也不应该忽略群落在物种水平和菌株水平的变异。

大部分的研究都证实了三种肠型的存在，最初的定义也已经明确了肠型是非离散的，聚类只是一种为了对样本分组以降低复杂性来定义肠型的方法 (见图3a集群和属丰度的比较)。尽管这一人为的定义存在局限性，由此产生的群落聚类只能部分地反映群落间距离的复杂结构，但肠型的概念已经证明对分析微生物组数据非常有帮助。

图3. 人类粪便样品微生物组存在结构亚型。
采用Jensen–Shannon距离排序278个MetaHIT样品。
a, 主要差异属的对数转换的相对丰度。在相邻的浮点轴上，展示了不同类型间投影丰度变化。图中的双峰丰度谱(虚线)和渐变丰度(实线)分别支持了梯度渐变(连续不可分)模型和非连续分组模型。
b, 三种肠型的COG排序投影也表明肠型间功能存在差异。
c, 宏基因组水平OTU的Shannon多样性指数和基因丰度（少于480000个基因定义为为低基因数，其它为高基因数）在不同肠型间显著不同，大多数为梯度渐变类型。
d, 饮食和疾病与普氏菌属（Prevotella）、厚壁菌门（Firmicutes）或拟杆菌门（Bacteroides）丰富的肠道菌群的关系（附表5）。为方便区分，在a, b, d中3种肠型均采用颜色区分。

随后对新数据集的研究也在不同程度上证明了肠型的存在，包括对肠型数量的验证和提供的统计学证据，当然也存在一些没有发现此类结构的研究(图2和附表1)。例如，一项关于美国人饮食的大数据分析结果支持2种肠型的结论，一种类型包含与ET P类似的优势类群，另一种为ET B和ET F类型的混合型。 HMP的16S数据，四个宏基因组数据和一个佛兰德人群数据的研究结果与肠型原始文献的结果类似，证明存在三种肠型。一项关于委内瑞拉、马拉维农村地区和美国大都会地区的人群研究则强调了普氏菌(Prevotella)和拟杆菌(Bacteroides)为驱动类群，另外还发现婴儿具有与成人完全不同的肠道菌群，主要含有双歧杆菌(Bifidobacteria)和变形菌(Proteobacteria)。研究发现，人类在3岁至9岁之间肠道菌群的肠型结构逐渐建立(发现类肠型结构)，表明基于有限样本时推断全世界不同年龄段人群肠道菌群的结构需要十分小心。

除聚类方法以外，Holmes等提出了另外一种区分菌群结构的方法。这种方法关注属水平的真实丰度而不是样品间距离，为每一个可能的结构生成一个模型，并确定每个模型如何解释观察到的数据。采用这种多项式混合模型(Dirichlet multinomial mixture models，DMMs)对肠型原始文献中的数据进行分析，证明很可能存在四种肠型(此处也笼统的称其为“集群”)。其中的两个集群类似于ET B和ET P，而第三个集群中瘤胃球菌(Ruminococcus)和厚壁菌(Firmicutes)内相关属为优势类群，但是这些类群在肠道菌群中通常含量很低。最后一个集群中则含有大量未鉴定的类群。DMMs还被用于分析瑞典健康人群的肠道菌群数据，结果确定了三个集群，同样有两个集群的群落组成类似于ET B和ET P，在另外一个集群中优势类群为一个未鉴定类群。另一项研究采用此方法对HMP中的16S rRNA基因数据进行分析，发现肠道微生物组有四个相似的模型。应用DMMs 分析MetaHIT宏基因组数据集时，可以确定四个集群，其中两个集群与ET B和ET P重合，而另两个集群为一个更复杂的混合群(图2，附图3)。然而DMMs属于更严格的统计方法，未来还需要进一步确认生成模型的分布假设是否适合微生物组数据。

尽管对肠型分类起主要贡献的三种肠道微生物——普氏菌(Prevotella)、拟杆菌(Bacteroides)和瘤胃球菌(Ruminococcaceae)是肠道菌群核心物种，但是有研究已经证明其相对丰度在个体间存在最大的变异。另外，基于总体数据的网络方法也确定这三种肠道微生物为三个共存网络集群的核心物种，并证明它们的丰度是相互负相关的。同样，一项关于肠道菌群内35个主要类群的的qPCR数据也展示了这样的负相关关系。此外，在阿米什成人肠道菌群中也存在3个不同的网络，这些网络中的优势属与原始研究中肠型的驱动类群高度重合。类似地，在一个由爱尔兰成年人和老年人组成的数据集里，报道了6个共丰度类群(co-abundance groups, CAGs)，且证明健康人群都具有和原始肠型相对应的网络结构。因此，有别于聚类和建模方法，细菌共存网络是另一种解释这些聚集群落主要特征的方法。理论研究已经证明在具有不同相互作用强度的群落中容易产生类似于肠型的结构。

尽管动物的肠道菌群与人类不同，但是最近在几项动物实验中也报告了类似于肠型的结构。在控制实验中，小鼠的肠道微生物群落中，聚类方法可以将其分成明显的集群，然而在野生动物(老鼠、灵长类和野猪)中，这种集群趋势则比较微弱。这表明，当没有外部因素影响微生物群落时，更容易出现聚集的群落状态。因此，肠型并不是人体肠道菌群特有的，动物中同样存在这些现象，这一结果使人们认为，肠型在泛人类分裂之前就已经存在了。肠道菌群在进化过程中主要受竞争影响，并且受到来自宿主的压力限制，因此，肠型可以代表这一共生群落的最适状态，以达到群体效应的局部最优，并兼容宿主所施加的压力限制。

定义微生物群落类型的挑战

鉴于从生态学到哲学的各个学科都在讨论微生物群落可能存在的状态，评估集群在肠道菌群研究中的作用是不容忽视的。考虑到肠型聚类的本质特性，以及对分类级别、距离指标、聚类算法和集群优化得分等方面的多种选择，在研究中产生不同数量的集群是不可以避免的(附图4和补充信息)，即使在相同的数据集上出现不同的集群数量也不足为奇。尽管一些人认为，有些数据集(引文8, 16, 23, 29, 42, 43)并不支持肠型的存在，但是当采用相同的方法将属于人体不同部位的样本(皮肤、粪便、阴道和口腔)区分开时，即使这一区分方法也没有多少统计支持(附图4)，这种区分方法却被科学界广泛接受。

不管聚类支持率还是建模假设(详见补充信息)，基于三大公共数据集的分析都可以得到来自文献报道的结论(附表1)，证明肠道菌群具有相似的的局部子结构，也就是3个集群的群落结构中总是存在拟杆菌属（Bacteroides）、普氏菌属（Prevotella）和厚壁菌门（Firmicutes）主导的集群，两个集群的群落结构中可以根据普氏菌属（Prevotella）的优势度来区分样品。因此，肠道菌群的划分在一定意义上是稳定的，因为相关的聚类可以重复，并可以协调许多研究和支持群落组成的存在。

在复杂的微生物组成背景下，不同环境中肠道群落显然会表现出一定的生物学差异。尽管合理的定义肠型和确定其临界点还有很大挑战，但是肠型的概念可以帮助我们更好的理解这些差异。这与大型生物研究中的集群概念是相似的，尽管到目前为止，区分不同类型的环境，也面临着相似的问题。例如，撒哈拉以南非洲地区的稀树、草原和森林生态系统可以作为对平均降雨量梯度变化或者稳定状态的对照。

考虑到准确定义肠道群落结构的挑战，如克服间歇效应，考虑干扰因子(附图5)和解释时间变异，肠型稳定状态的确切数字是很难确定的。尽管如此，在许多研究(主要为西方)中，无论应用什么方法，拟杆菌属（Bacteroides）和普氏菌属（Prevotella）都是个体间最主要的差异类群，并能够解释最主要的变异。不同肠型间的微生物组成和多样性上都有很大的不同，在随后的讨论中，有关它们的功能、生态和疾病等方面的情况都将涉及。尽管三种肠型可能不是对数据的最佳解释，但它是最常用的模型，并且为我们研究肠道菌群提供可直接使用的框架。

肠型在功能与生态中应用

肠型间的物种组成不同表明其在功能和生态学意义上也不同。基于三大数据集的分析结果也表明微生物群落组成的差异导致了显著的功能变异(图3b)。事实上，考虑基因类型时，**大多数KEGG(京都基因与基因组百科全书)直系同源(KO)和非监督同源组(non-supervised orthologous
groups，NOGs)在三种肠型间存在64%和77%的差异(假阳性率FDR < 0.1)。同样在eggNOG功能分类中，25个分类中23个存在显著差异(附图6)。其它的模型选择二种或四种肠道分型方法，仍然存在广泛的功能差异(附表3)，尤其与碳代谢高度相关。** 例如，报导过ET P肠型或者普氏菌属（Prevotella；无肠型的报导)的研究，通常来自非西方或者饮食富含纤维的人群样本。这一关联让我们更容易理解菌群功能的差异，普氏菌属（Prevotella）水解酶专门分解植物纤维，另外，有研究发现ET P群落可以导致脂肪和蛋白的分解发酵能力下降。相反的，ET B群落结构与富含动物蛋白和饱和脂肪酸饮食相关，并且具有拟杆菌(Bacteroides)特异的碳水化合物酶(CAZymes)(附表2)。此外，我们发现在ET B群落中碳水化合物代谢酶显著富集(附表3)，与最近关于糖和蛋白水解的潜能增加的研究一致。一些肠型间的功能差异可归因为某个指示属，另一些只是结构变化被动导致的(总量不变，相对增长就会有相对减少)。

肠型间的功能差异支持了不同群体特征的概念，如丰富度、多样性和时间稳定性。从生态学的角度来看，这些特征都是相关的，理论预测了诸如肠道之类的动态系统的高多样性，其营养供应和类型随着时间的变化而波动。最早在阿米什人中采用16S扩增子测序报导了三种肠型的物种丰度不同，ET B有最低的物种丰度，此结果在最近一个更大的群体研究中被验证。我们使用三个大的数据集分析，发现ET B种物种丰度最低，而ET F中物种丰度最高(附图7，8)。采用香农指数同样发现ET F中物种丰度最高，而ET B和ET P中物种多样性均下降(附图8)。此外，这种差异与粪便稠度和/或样品转运时间的差异密切相关，其中转运较慢的ETs也显示了蛋白水解对糖精蛋白和蛋白水解代谢产物的相对比升高。

在许多研究中，健康成人的肠道群落组成在很长一段时间内不会发生显著变化，表明成人体内生态系统与肠型状态普遍比较稳定。然而，也有例外，我们在分析HMP宏基因组时间序列数据中，其中也包括超过6个月个人样品，其中三种肠型稳定存在，但也有16%的样品肠型存在变化。这也表明：对于一些个体，肠型是可变的，且不存在明显的边界(附图9)。
这一结果可以用肠道菌群的可变动态模型来解析：
(1) 偏好性群落组成的存在(即肠型，附图10A);
(2) 个体特异性吸引子(attractors)的存在主要是由于个体的肠道群落的时间自相关(附图10B)。
证明这些模型需要有关微生物群落对不同干扰下反应的信息，从而使我们能够确定个体是否有能力保持/恢复到原来的组成状态或肠型。不幸的是，目前我们只有非常有限的肠道菌群干扰数据，如抗生素、粪便移植和饮食干预，并且许多数据都被排除在肠型定义的框架之外，所以很难得出哪个稳定状态的模型是正确的结论。
短期的抗生素治疗对人类肠道菌群的影响太剧烈，可以导致整个群落的瓦解，不适合研究肠道菌群的恢复能力。事实上抗生素治疗可产生严重的菌群破坏，导致病原的入侵(如艰难梭菌)，并导致无法恢复至最初的菌群状态。

饮食干预对人类肠道菌群生态系统的影响更温和，因此适合用于研究肠道菌群的可塑性。研究发现，饮食干预可以在4天内导致肠型的改变，但是10天后趋于稳定，表明肠道菌群存在一种恢复至原始状态的能力。采用普氏菌与拟杆菌相对比例定义肠型的分类方法，这种稳定性在6个月的干预实验中同样被观测到。这一结果表明，个人的微生物组因短期饮食干预受多大影响还有待进一步研究，但支持肠型恢复能力的假说。与之相比，长期的干预可能产生更深选的影响，长达一年的饮食干预导致拟杆菌门（Bacteroidetes）/厚壁菌门（Firmicutes）比例发生变化，从而导致肠型的改变。随着时间的推移，肠型通常变得比较稳定。对于长期干预缺少后续的研究，更没有对其恢复力的近似研究(无论是从整体的群落相似性还是肠型的分类)。然而，有研究也暗示不同肠型可能恢复能力也不同，例如，据估计ET F中总体细菌的生长率最低，可能导致平衡状态恢复的延迟。

虽然目前还不能预测特定的扰动将如何改变微生物组，但不同的微生物组结构，包括那些被定义的肠型结构，可能会在未来作为分类治疗和指导饮食的建议。肠道菌群的调节对疾病尤其重要，目前的挑战在于如何将一个人改变了的微生物组转变回发病之前的健康状态(菌群恢复或菌群人工调控)。

肠型在临床应用

按照肠型对肠道菌群结构分类具有潜在的临床意义。首先，在诊断上有助于判别个体的疾病状态。其次，可作人体特定状态的风险或易感指标。再次，层化可作为预后恢复的生物标记物。第四，不同肠型可影响异质性物质代谢，从而产生不同的药物代谢动力学、药物代谢动态差异。因此，肠道分型可作为指导治疗的选项，有助于理解不同的治疗措施。

目前，已经有一些肠型(或者主要的驱动物种)与人类疾病表型相关的报导。例如，增加拟杆菌或ET B肠型本身通常具有低的微生物多样性(附图7/8)，这与非酒精性脂肪肝炎(NASH)、结肠癌、乳糜症、免疫衰老和长期低度感染相关。在MetaHIT数据中，ET B与ET F相比(FDR < 0.1)，淋巴细胞数量和C反应蛋白显著增长，同时ET F样品有低于平均水平的胰岛素抗性水平(附图4)。普氏菌属（Prevotella）丰度的增长与长期抗生素使用、风湿性关节炎、二型糖尿病和HIV相关(HIV在男同中高风险，可能混淆报导的关联)。最后，ET F具有高的微生物多样性，且能够降低宿主感染程度，且报导与动脉硬化风险相关。鉴于不同疾病表型的大量关联，肠型并不能单独作为疾病诊断指标，但可以指示某些方面的风险。目前，在特定状态下，健康个体疾病风险与肠型的关系研究的还很少，而且尚不清楚肠道菌群分类是否对疾病发展的预后有帮助。例如，在具有克罗恩病杂合等位基因易患克罗恩病的个体中，容易出现ET P肠型；而在MetaHIT研究中，克罗恩病风险人群中中以ET B为主，表明炎症可以影响这两种肠型相互转换，从而增加患炎症性肠病的风险。

最后，某些疾病可能会有不同的病因，这可能与肠型相关。分层可以帮助我们发现这些潜在的信号，从而消除个体间微生物群落巨大变异的部分，而这些个体间的差异可能与疾病本身无关。在小鼠研究的例子中，分层可以发现基因型与微生物组、笼子与微生物组的关联。同样地，将人类患者分层为八个微生物集群，有助于识别与微生物组成相关的医学参数，显著提高艰难梭菌(C. difficile)相关腹泻分类的准确性。虽然目前没有长期观测的数据，但对饮食和药物的反应以及肠道生理和生活方式的影响，也可能因人体不同位置而有所不同。因此，分层代表了不同临床相关领域的切入点。它可以在很大程度上独立于梯度-或以集群为中心的观点，类似于身体质量指数，定义的阈值是对患者疾病风险的重要指南。

更合理肠型分类的准则

为了使肠型概念更有意义，标准化是必不可少的。除了上文提到的技术困难外，单个样品的分类也受到同批次其它样品的影响。这种方式定义的肠型在不同研究中很难比较。例如，在一次单独的研究中，大部分的样品为ET B和ET F，只有极少的ET P，最优的聚类可能只有两个或一个组。尽管如此，这些少量的ET P还是可以基于其它的数据库来鉴定。比较不同的研究数据是比较困难的，因为不同的DNA提取方法、样本处理方法、测序技术、引物选择、数据处理过程(如rRNA聚类OTUs、拷贝数校正、嵌合体检测)等导致细菌丰度检测产生偏差(bias)，从而影响肠型的分类。在标准化这些步骤时，需要非常严格的标准，也许需要与人工重组微生物群落 结合在一起，并扩展到肠道中发现了的大量微生物系统基因谱，从而使标准样品和临床样本之间具有可比性。此外，还需要更多的纵向研究，包括跨越多个大陆的更大的人群研究，以确定额外的混杂因素。事实上，几个联盟己在这方面做出努力，如国际人类微生物组标准(IHMS)，微生物组质控计划(MBQC，之前推送的两篇Nature Biotechnolog报导的DNA提取，以及实验与分析比较均是他们的工作)己经在尝试建立宏基因组学标准，并确定变异的来源。

我们提出了一个可操作的肠型分类方案，它可以避开上面列出的许多问题，并可以提供更多可比较的结果(图4)。我们并不希望限制你对数据意义的解析，但至少可以将其他方法的分析结果与按此流程分析的结果进行比较。基于MetaHIT数据集，我们建立了一个基于属水平的在线分类器(基于HMP1和中国二型糖尿病 http://enterotypes.org/)。如果重新聚类的结果与分类器的结果不同，我们建议谨慎地将分层结果与该元分析中描述的肠型结果进行比较。
此外，这种方法还定义了肠型空间，通过确定哪些样本与参考数据集相似，可以用来定义“正常”肠道菌群的界限，并识别出它们之外的样本，可以作为一个健康指标。以前也报导过非正常的疾病状态，通过使用一种包含六个物种的群落模型，在相对健康的病人中，网络分析显示出类似三种肠型的结构为主要类型，而在脆弱的、年老的病人中，有两个新的类型位主要类型。另一个病例报告了一种新的肠杆H，以肠杆菌科（Enterobacteriaceae）为主要类群。肠型分类器只基于现有数据，如果与已知数据不相似会排除在肠型分类之外。个体的菌群异常，通常由肥胖、NASH，高血乙醇和ROS水平引起，表明非正常的组成与消化异常有关。

图4. 基于菌群结构鉴定肠型的技术路线
根据微生物丰度数据确定肠型的推荐流程图。
获取肠型分类的两种主要途径分别为：重鉴定（de novo identification；左侧路线图，可发现新肠型）和基于已知参考数据集的肠型分类（右侧路线图）。
依据现有模型推断群落数据的可能结构：
(1) 先基于聚类强度参数（clustering
strength measures，附图4）或使用DMM模型框架对数据进行评估，确定是否有集群结构存在。其他模型也可能有助于获取菌群数据的结构状态，但目前这类方法的具体应用还没有实现。
(2) 将样品与HMP1和MetaHIT6数据进行相似性比较以确定是否为已知肠型，在http://enterotypes.org网站可实现肠型的分类和检查。
(3) 不同的组成和结构会有许多不同的原因，例如样品来源不同，可能来自于非西方人或婴儿样本，技术性问题不同，如DNA提取、引物和分析预处理偏差等。
(4) 分类器结果的一致性，可用silhouette指数来确定。

无论是用于疾病状态识别、前瞻性分型还是解决目前存在的技术问题，标准化的肠型分类才能确保大范围研究的可比性，并有助于我们理解肠型的作用和重要性。

结论

与人类肠道菌群结构有关的主要模式的鉴定仍然充满挑战性。目前可用的研究方法，每种都有各自的优点和适用范围，鉴定出的肠型的数量和统计支持也可能会有所不同。随着标准化流程的发展，对样品处理和数据分析的控制，可以预期未来不同研究间结果的一致性会增加。通过添加更广泛的样本和背景信息，可以进一步细化肠型的属性，扩展到工业化世界之外以更好地代表全球人口的特征。但是现在，我们在这里提出了一种限制肠型空间的方法，以期对己知肠型之外的样本也可进行检测。

除了上文提到的许多困难，尽管有不同的统计支持，但多项研均究报导了具有相似菌群组成特征的肠型。尽管肠型并非明显的离散，且受到许多因素影响，但是它们在在分类、功能和生态特性上都有差异，并且可以在大型数据集上精确地重现。它们代表了一种获取人类肠道中首选的微生物组成的方法，因此也可以应用于许多其他生态系统中。

仅仅依靠肠型分类可能会掩盖潜在的重要的微生物变异，因此不能取代直接的临床关联分析和专业的统计分析在微生物物种和功能差异研究中的应用。然而，肠型仍与多种临床情况有关，如从直接的疾病关联到前瞻性分型研究，甚至是个性化的饮食干预或其他肠道菌群调节治疗。尽管我们目前了解的知识非常有限，但我们相信肠型可以成为研究人类肠道菌群的有用工具。

肠型分类器的在线使用

肠型在线分类器主页: http://enterotypes.org/

你只要提交一个属水平的OTU表文件，格式如下：

GENUS   MH0277  MH0087  MH0156
Bacteroides 0.005   0.732   0.501
Prevotella  5.359-06    0   0
Eubacterium 6.148-05    0   0.046
...         

即可获得基于参考数据肠型分类的结果汇总如下：

同时下载可以下载每个样品的分类详细结果，示例如下：

ET Within_ET_space 
MH0277 ET_F FALSE  
MH0087 ET_B TRUE   
MH0156 ET_B TRUE   
MH0444 ET_B TRUE   

热心肠日报导读

Nature子刊：利用“肠型”对肠道菌群进行分类

原标题：肠道菌群群落组成中的肠型

① 2011年，MetaHIT团队提出“肠型”概念，将肠道菌群分为B、P和F三类；② 这有潜在研究和临床价值，但争议不小，不同人根据不同试验、算法和分析方法，认为菌群应分为2种、4种肠型甚至是连续不可分型；③ 为统一认识和指导实践，29位世界主流菌群科学家联合提出新的肠型分类器及公开比对数据库；④ 新方案充分利用和验证HMP等数据库，综合考虑菌群功能、生态学及临床需求，能更好指示出疾病和健康状态的菌群类型；⑤ 共识仍存局限，但意义重大。

Reference

1. Costea, P. I., et al. (2018). “Enterotypes in the landscape of gut microbial community composition.” Nat Microbiol 3(1): 8-16.
2. Nature子刊：利用“肠型”对肠道菌群进行分类 http://www.xunludkp.com/papers/read/1067264900?kf=bayi
3. 注：译文中原始文献、数据、结果等均指提出肠型概念的原始文献：Arumugam, R. et al. (2011). Enterotypes of the human gut microbiome. Nature, 473: 174–180.

文章译者简介

陈亮，博士。2010年毕业于鲁东大学生物技术专业，2017年于中国科学院微生物研究所获微生物学博士学位。目前就职于中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室，生物信息和计算生物学研究组，任助理研究员，目前主要研究内容为微生物生态学、宏基因组学等方面的数据挖掘和分析。

刘永鑫，博士。2008年和2011年毕业东北农业大学微生物学和作物遗传育种专业。2014年在中科院遗传发育所获生物信息学博士学位，2016年博士后出站留所工作，任宏基因组学实验室工程师，目前主要研究方向为宏基因组学数据分析方法、培养组学方法优化。2017年7月创办“宏基因组”公众号，半年关注人数过万，累计阅读超百万。

宏基因组/微生物组是当今世界科研最热门的研究领域之一，为加强本领域的技术交流与传播，推动中国微生物组计划发展，中科院青年科研人员创立“宏基因组”公众号，目标为打造本领域纯干货技术及思想交流平台。公众号每日推送，工作日科研思路、实验和分析技术，理论过硬实战强；周末科普和生活专栏，轻松读文看片涨姿势。目前经过近半年发展，分享过百篇原创文章，已有12000+小伙伴在这里一起学习了，感兴趣的赶快关注吧。