- 1 ChIP-Seq技术
- 1.1 概念
- 1.2 ChIP-seq技术原理
- 2 ChIP-Seq数据分析
- 2.1 数据下载
- 2.2 质量控制(data_assess)
- 2.3 比对到参考基因组(mapping_analysis)
- 2.4 搜峰(Peak_calling)
- MACS2
- 2.4.1 MACS2 核心: callpeak 用法
- 2.4.2 callpeak 结果文件说明
- 2.4.3 bdg file → wig file
- MACS2
- 2.5 峰注释(Peak_anno)
- ChIPseeker
ChIP-Seq仅仅是第一个表观遗传学领域比较成熟的技术而已,目前还有很多其他的技术,比如说
DNA修饰: DNA甲基化免疫共沉淀技术(MeDIP), 目标区域甲基化,全基因组甲基化(WGBS),氧化-重亚硫酸盐测序(oxBS-Seq),
TET辅助重亚硫酸盐测序(TAB-Seq)
RNA修饰: RNA甲基化免疫共沉淀技术(MeRIP)
蛋白质与核酸相互作用: RIP-Seq, ChIP-Seq, CLIP-Seq
还有最近比较火的 ATAC-Seq ATAC-seq 能干啥?(
http://www.biotrainee.com/thread-1218-1-1.html
)
1 ChIP-Seq技术
1.1 概念
染色质免疫共沉淀技术 (Chromatin Immunoprecipitation, ChIP
)也称结合位点分析法,研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种方法,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。
将 ChIP 与 第二代测序技术 相结合的 ChIP-seq技术
,能高效的在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA片段。
1.2 ChIP-seq技术原理
在生理状态下,把细胞内的DNA与蛋白质交联(Crosslink)后裂解细胞,分离染色体,通过超声或酶处理将染色质随机切割;
利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来;
再通过反交联(Reverse crosslink)释放结合蛋白的DNA片段;
纯化;
测序获得DNA片段的序列,最后将这些DNA片段比对到对应的参考基因组上。
![这里写图片描述](https://img-
blog.csdn.net/20180814104707287?watermark/2/text/aHR0cHM6Ly9ibG9nLmNzZG4ubmV0L3dlaXhpbl80MTc0NTg1OA==/font/5a6L5L2T/fontsize/400/fill/I0JBQkFCMA==/dissolve/70)
2 ChIP-Seq数据分析
2.1 数据下载
GSE98149 (包含H3K9me3的全部阶段,H3K4me3和H3K27me3的zygote、E6.5 Epi、E6.5 Exe、E7.5
Epi、E7.5 Exe、E8.5 embryo、Esc)
Title:Reprogramming of H3K9me3-dependent heterochromatin during mammalian
early embryo development [ChIP-seq]
Organism:Mus musculus
for ((i=594;i<=670;i++));
do
wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP105/SRP105176/SRR5479$i/SRR5479$i.sra;
done &
[/code]
```code
# sratookit: .sra 文件 → fastq文件
ls *sra |while read id;
do
/home/chen/sratoolkit.2.8.2-ubuntu64/bin/fastq-dump --gzip --split-3 $id;
done &
# 下载小鼠参考基因组的 index
wget -c "ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/data/bowtie2_indexes/mm10.zip" &
# 解压
unzip mm10.zip &
[/code]
## 2.2 质量控制(data_assess)
```code
# Fastqc 进行质控
ls *fq | while read id; do fastqc -t 4 $id; done &
# multiqc:质控结果批量查看
multiqc *fastqc.zip --export &
[/code]
```code
## trimmomatic
# 安装 trimmomatic
wget -c http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic/Trimmomatic-0.38.zip &
unzip Trimmomatic-0.38.zip
# 数据清理
# -threads 设置多线程运行
java -jar "/data/chen/biosoft/Trimmomatic-0.38/trimmomatic-0.38.jar" PE -threads 2 -phred33 \
# 2个输入文件
${name}_1.fq.gz ${name}_2.trim.fq.gz \
# 4个输出文件
${name}_R1.clean.fq.gz ${name}_R1.unpaired.fq.gz \
${name}_R2.clean.fq.gz ${name}_R2.unpaired.fq.gz \
# ILLUMINACLIP:去接头
# "$adapter"/Exome.fa :adapter 序列的 fasta 文件
# 2:16 个碱基长度的种子序列中可以有 2 个错配
# 30:采用回文模式时匹配得分至少为30 (约50个碱基)
# 10:采用简单模式时匹配得分至少为10 (约17个碱基)
ILLUMINACLIP:"$adapter"/Exome.fa:2:30:10 \
# LEADING:3,从序列的开头开始去掉质量值小于 3 的碱基;
# TRAILING:3,从序列的末尾开始去掉质量值小于 3 的碱基;
# SLIDINGWINDOW:4:15,从 5' 端开始以 4 bp 的窗口计算碱基平均质量,
# 如果此平均值低于 15,则从这个位置截断 read;
# HEADCROP:<length> 在reads的首端切除指定的长度;
# MINLEN:36, 如果 reads 长度小于 36 bp 则扔掉整条 read。
LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 HEADCROP:10 MINLEN:36
[/code]
![这里写图片描述](https://img-
blog.csdn.net/20180904092004409?watermark/2/text/aHR0cHM6Ly9ibG9nLmNzZG4ubmV0L3dlaXhpbl80MTc0NTg1OA==/font/5a6L5L2T/fontsize/400/fill/I0JBQkFCMA==/dissolve/70)
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blog.csdn.net/20180904092011835?watermark/2/text/aHR0cHM6Ly9ibG9nLmNzZG4ubmV0L3dlaXhpbl80MTc0NTg1OA==/font/5a6L5L2T/fontsize/400/fill/I0JBQkFCMA==/dissolve/70)
## 2.3 比对到参考基因组(mapping_analysis)
Bowtie2 或 BWA
```code
# bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]
# -p/--threads NTHREADS 设置线程数. Default: 1
# -q reads 是 fastq 格式的
# -x <bt2-idx> index 路径
# -1 <m1> 双末端测序的 _1.fastq 路径。可以为多个文件,并用逗号分开&#