【实验技术笔记】miRNA靶序列寻找及miRNA检测

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1. microRNA 的基本知识

• microRNA（miRNA）是一类长度在 22nt 左右的小 RNA 分子，它并不编码蛋白质，因此 miRNA 与 siRNA 和 circRNA 等小 RNA 分子一样，也是一种非编码 RNA。
• miRNA 的生物合成：pre-miRNA 加工成短一点的 pri-miRNA，最后再加工成成熟的 miRNA。大部分路径最后得到的 miRNA 成熟体的结构都一样，都是一段 22nt 左右的双链 RNA 分子。
  
• miRNA 的作用方式：与 siRNA 类似，通过和靶基因 RNA 的碱基互补配对从而引导沉默复合体（RISC）降解 RNA 或阻碍 mRNA 翻译成蛋白质。不同的是，miRNA 主要结合在 mRNA 的 3’UTR 部分。
• miRNA 的基本作用机制：
  • 1、抑制蛋白翻译（4 种不同的方式）：(1) 使正在翻译的蛋白发生降解；(2) 抑制翻译延伸；(3) 使翻译过早终止（使核糖体从 RNA 上提早掉下来，没法行使翻译功能）；(4) 抑制翻译起始。
  • 2、通过不完全的 miRNA-mRNA 互补配对诱导靶 RNA 降解。
  • 3、在 mRNA 加工体或 P 体等独立细胞质位点，通过隔绝靶 mRNA 与翻译机器使其沉默。
  • miRNA 基本作用机制的综述：Getting to the Root of miRNA-Mediated Gene Silencing. Ana Eulalio, Eric Huntzinger, and Elisa Izaurralde. Cell. 2007. (DOI 10.1016/j.cell.2007.12.024).
• 由于 miRNA 的作用机制是比较复杂的，所以在检测 miRNA 作用时，检测一下它的靶基因的 RNA 水平的表达，还要检测一下靶基因的蛋白表达。
• miRNA 可以调控基因的表达水平，但调控方式并不需要严格的序列特异性，不需要与目的基因严格匹配。miRNA 经典的作用途径是通过与各种 mRNA 的 3’ UTR 进行互作，这些互作位点与 miRNA 的“seed sequence” 种子序列区（通常是 miRNA 5’端的第 2-7 位碱基）相匹配，所以我们在寻找 miRNA 的靶点基因时，通常是去寻找与“seed sequence”完美匹配的基因。
• 许多 miRNA 与靶序列的结合都只是粗略的结合，并不会进行持续配对，而是会在“seed sequence”区出现凸起和摆动，这是一个动态的过程，所以在不同物种、不同细胞类型、甚至同种细胞的不同事件过程中࿰