【实验技术笔记】miRNA靶序列寻找及miRNA检测

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1. microRNA 的基本知识

• microRNA（miRNA）是一类长度在 22nt 左右的小 RNA 分子，它并不编码蛋白质，因此 miRNA 与 siRNA 和 circRNA 等小 RNA 分子一样，也是一种非编码 RNA。
• miRNA 的生物合成：pre-miRNA 加工成短一点的 pri-miRNA，最后再加工成成熟的 miRNA。大部分路径最后得到的 miRNA 成熟体的结构都一样，都是一段 22nt 左右的双链 RNA 分子。
  
• miRNA 的作用方式：与 siRNA 类似，通过和靶基因 RNA 的碱基互补配对从而引导沉默复合体（RISC）降解 RNA 或阻碍 mRNA 翻译成蛋白质。不同的是，miRNA 主要结合在 mRNA 的 3’UTR 部分。
• miRNA 的基本作用机制：
  • 1、抑制蛋白翻译（4 种不同的方式）：(1) 使正在翻译的蛋白发生降解；(2) 抑制翻译延伸；(3) 使翻译过早终止（使核糖体从 RNA 上提早掉下来，没法行使翻译功能）；(4) 抑制翻译起始。
  • 2、通过不完全的 miRNA-mRNA 互补配对诱导靶 RNA 降解。
  • 3、在 mRNA 加工体或 P 体等独立细胞质位点，通过隔绝靶 mRNA 与翻译机器使其沉默。
  • miRNA 基本作用机制的综述：Getting to the Root of miRNA-Mediated Gene Silencing. Ana Eulalio, Eric Huntzinger, and Elisa Izaurralde. Cell. 2007. (DOI 10.1016/j.cell.2007.12.024).
• 由于 miRNA 的作用机制是比较复杂的，所以在检测 miRNA 作用时，检测一下它的靶基因的 RNA 水平的表达，还要检测一下靶基因的蛋白表达。
• miRNA 可以调控基因的表达水平，但调控方式并不需要严格的序列特异性，不需要与目的基因严格匹配。miRNA 经典的作用途径是通过与各种 mRNA 的 3’ UTR 进行互作，这些互作位点与 miRNA 的“seed sequence” 种子序列区（通常是 miRNA 5’端的第 2-7 位碱基）相匹配，所以我们在寻找 miRNA 的靶点基因时，通常是去寻找与“seed sequence”完美匹配的基因。
• 许多 miRNA 与靶序列的结合都只是粗略的结合，并不会进行持续配对，而是会在“seed sequence”区出现凸起和摆动，这是一个动态的过程，所以在不同物种、不同细胞类型、甚至同种细胞的不同事件过程中，miRNA 的靶基因都可能是不同的，介导了各不相同的功能。所以使用不同细胞进行实验，或者使用同种细胞检测不同生物学过程时，都要考虑选择更合适的 miRNA，而不是生搬硬套。
• miRNA 能结合 mRNA 的 3’UTR，也能结合 mRNA 的 5’UTR，还能结合不编码蛋白的 RNA，这也就意味着 miRNA 不光能抑制编码基因（mRNA），还能抑制非编码基因。
• miRNA 不适合作为基因敲降的工具。一个 miRNA 可能靶向很多个基因，一个基因也可能被多个 miRNA 调控，且只有部分 RNA 能被 miRNA 调控，多数 RNA 不是直接受 miRNA 调控的。

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2. miRNA 的基本操作

2.1 miRNA 靶序列寻找

2.2.1 TargetScan

• TargetScan 由麻省理工学院的 BenjaminLewis 等人在 2003 年开发，它通过搜索与每个 microRNA 的种子区匹配的保守位点（非保守位点也可预测）而预测 microRNA 的靶基因，提供每个 microRNA 预测靶点的准确排名，排名基于进化上保守的靶定概率（PCT 得分）或抑制的预测效果（背景+得分）。

• 核对物种 → 填入基因名 → 填入 microRNA 名。
  

• 预测人的 hsa-miR-21 靶基因首先会弹出下图这个选项，这是因为 miR-21 和 miR-590 种子序列相同导致的，选择第一个 broadly conserved（保守的）一栏的 microRNA。
  

• 结果如下图：
  

• 点击第二行的 SitesinUTR，可以看到预测的 hsa-miR-21-5p 与 ZNF367 的结合位点情况，还可以看到另外有哪些 miRNA 靶向该基因。带边框的是选中的 miRNA，下拉可以看到 miRNA 和该靶基因的具体结合位点。
  
  

• 8mer、7mer 的定义：
  

2.1.2 miRBase

• miRBase 除了是 microRNA 序列查询的工具，也可以预测靶基因。
  

• 在右侧的 Search by miRNA name or keyword 一栏输入 hsa-miR-21，可以获得 hsa-miR-21 的前体序列还可以分别查看其 5p, 3p 成熟体序列（前体加工后靠近 5’端的或 3’端的序列），下拉在成熟 miRNA 的 Predictedtargets 一栏点击该 microRNA 的名字即可查看其靶基因，点击 TARGETSCAN-VERT 一栏可以查看是否与直接使用 TargetScan 预测的一样。
  
  
  

• 如果要做 miRNA 表达，可以把成熟 miRNA 序列合成 mimics，然后转染细胞。

• 如果要构建载体，则需要用 miRNA 的前体序列构建到含 H1 启动子的载体中，然后转染细胞。

2.2 miRNA qPCR 检测

• 关键点是引物设计和反转录过程

2.2.1 引物设计

• 由于 miRNA 只有 22nt，而 qPCR 要求模板至少 80bp，因此要将 miRNA 加长，给 miRNA 加一段接头，根据加的接头不同，miRNA qPCR 方法就有很多种，如茎-环法（stem-loop）。

使用软件设计引物

• sRNAPrimerDB 简单好用，但是服务器不稳定，可能刷不出来。
  
  
  ◆ RTprimer(specific) 是根据输入的 miRNA 序列得出的 RT-PCR 引物
  ◆ Rp 是 qPCR 反向引物。
  ◆ Fp-1 正向 qPCR 引物提供了多条，任选其一即可（可以先做一下引物评价）。

手动设计引物

◆ 原理：给 miRNA 加 stem-loop 接头，stem-loop 的部分碱基与 miRNA 互补配对，反转录后就能把 miRNA 和 stem-loop 连接起来，stem-loop 拉直后就给 miRNA 加了延长的小尾巴，再用与之适配的 qPCR 引物就能进行 qPCR 扩增。

◆ 因此设计引物时，需要设计两种引物：

① 反转录引物：具有茎换结构。

• 反转录引物框架：通用的 Stem-loop adaptor + miRNA 后 6 位碱基的反向互补序列
  通用的 Stem-loop adaptor：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC
  

② qPCR 引物

• qPCR 反向引物：需要特别设计。
  软件设计的 qPCR 正向引物的 3’端与反转录产物的互补序列（正义链）5’端是一样的，与 miRNA 的 5’端也是一样的。此外，为了保持 GC 含量平衡，在 qPCR 正向引物的 5’端加了一些碱基（软件的优势，可以自动计算并加上一些碱基）。
• qPCR 反向引物：与反转录产物的互补序列的 3’端互补配对，且与 stem-loop 的 5’端一样。stem-loop 是通用的，所以反向引物也是通用的：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-3'。
  

2.2.2 反转录

（1）反转录体系：

• 两种引物：针对 miRNA 设计的特异的 stem-loop 引物（可以同时加几种，但不要加太多）和随机引物（检测内参，检测 miRNA 用的内参常用 U6、5S）
• 推荐反转录试剂盒：TOYOBO FSK100
  

（2）反转录条件设置：（优化版，与一般试剂盒条件不同）

• 后续 qPCR 检测同 mRNA qPCR 检测。
  参考：【实验技术笔记】RNA 抽提 + 反转录 PCR + PCR 引物设计 + RT-qPCR

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