使用 Cell Ranger 分析单细胞数据
1. 数据转换 BCL2FASTQ
在进行单细胞数据分析之前，需要将 Illumina 测序仪生成的 BCL 格式数据转换为 FASTQ 格式。这一步通常使用 bcl2fastq 软件完成。
1.1 安装 bcl2fastq
bcl2fastq 是 Illumina 提供的软件，用于将 BCL 文件转换为 FASTQ 文件格式，以便进行下游分析。以下是安装步骤：
- 访问 Illumina bcl2fastq 下载页面 并下载对应版本的软件。
- 解压下载的文件，并按照安装说明进行安装。
# 下载 bcl2fastq 软件
wget https://support.illumina.com/downloads/bcl2fastq/1.8.4/bcl2fastq-1.8.4-0-Linux-x86.tar.gz
# 解压文件
tar -xzf bcl2fastq-1.8.4-0-Linux-x86.tar.gz
# 进入解压后的目录
cd bcl2fastq-1.8.4-0-Linux-x86
# 运行安装脚本（如果存在）
./install.sh
1.2 运行 bcl2fastq
使用以下命令运行 bcl2fastq 进行数据转换：
bcl2fastq --input-dir <BCL文件夹路径> --output-dir <FASTQ输出路径> --sample-sheet <样本信息表路径>
<BCL文件夹路径>是包含 BCL 文件的目录路径。<FASTQ输出路径>是您希望输出 FASTQ 文件的目录路径。<样本信息表路径>是包含样本信息的 CSV 文件路径，用于指定样本名称和其他相关信息。
例如，如果您的 BCL 文件位于 /data/bcl 目录，您希望输出 FASTQ 文件到 /data/fastq 目录，并且样本信息表位于 /data/samples.csv，则命令如下：
bcl2fastq --input-dir /data/bcl --output-dir /data/fastq --sample-sheet /data/samples.csv
1.3 检查输出结果
转换完成后，检查输出目录中的 FASTQ 文件，确保转换成功。
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2. 数据质控
在进行单细胞数据分析之前，需要对测序数据进行质控，以确保数据质量符合分析要求。常用的质控工具是 FastQC。
2.1 安装 FastQC
FastQC 是一个广泛使用的测序数据质控工具，它可以评估测序数据的质量，包括碱基质量、reads长度、reads数量等。
- 下载 FastQC：
- 访问 FastQC 官方网站 并下载 FastQC 软件。
- 解压下载的文件，并根据指南进行安装。
# 下载 FastQC 软件
wget https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.9.zip
unzip fastqc_v0.11.9.zip
- 安装 FastQC：
- 将解压后的文件移动到合适的目录，并添加执行权限（如果需要）。
- 运行 FastQC 以检查其是否正确安装。
2.2 运行 FastQC
使用以下命令运行 FastQC 对 FASTQ 文件进行质控：
fastqc -t 12 -f fastq -o qc1 pbmc_1k_v3_fastqs/pbmc_1k_v3*_R2_001.fastq.gz
- 其中
-t 12指定使用 12 个线程运行。 -f fastq指定输入文件格式为 FASTQ。-o qc1指定输出目录为qc1。pbmc_1k_v3_fastqs/pbmc_1k_v3*_R2_001.fastq.gz是需要进行质控的 FASTQ 文件路径。
2.3 查看质控报告
运行完成后，FastQC 会生成质控报告，通常包括 HTML 和文本格式。这些报告提供了关于数据质量的详细信息，包括碱基质量分布、reads质量分数、reads长度分布等。
- 打开 HTML 报告文件，仔细查看各项指标，确保数据质量符合后续分析的要求。
- 根据质控结果，可能需要过滤掉低质量的reads或进行其他预处理步骤。
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3. 生成矩阵 COUNT
使用 Cell Ranger 软件对原始数据进行比对和定量分析，生成基因表达矩阵。Cell Ranger 能够处理 FASTQ 格式的测序数据，并将其比对到参考基因组上，最终生成用于下游分析的基因表达矩阵。
3.1 运行软件
Cell Ranger count 工具将执行以下步骤：
- 比对测序数据到参考基因组。
- 进行UMI计数（Unique Molecular Identifier）以去除PCR重复。
- 生成基因表达矩阵。
- 命令格式：
cellranger count --id=<analysis_id> --fastq=<path_to_fastq_files> --sample=<sample_name> --transcriptome=<path_to_reference_transcriptome> --localcores=<cpu_cores> --localmem=<memory_size>
- **示例命令**：
```bash
cellranger count --id=run_count_1kpbmcs --fastqs=pbmc_1k_v3_fastqs --sample=pbmc_1k_v3 --transcriptome=/ifs1/VipData/15-singlecell/ref/refdata-gex-GRCh38-2020-A/ --localcores=12 --localmem=32
- 在这个示例中，
<analysis_id>是分析的标识符，<path_to_fastq_files>是 FASTQ 文件的路径，<sample_name>是样本名称，<path_to_reference_transcriptome>是参考基因组的路径，<cpu_cores>和<memory_size>分别指定了使用的 CPU 核心数和内存大小。
3.2 结果文件
Cell Ranger 的分析结果会保存在指定的输出目录中，主要文件包括：
web_summary.html：网页版报告，包含测序统计、细胞统计、比对统计等信息。metrics_summary.csv：CSV 格式的统计摘要。possorted_genome_bam.bam：比对排序后的 BAM 文件。filtered_feature_bc_matrix：过滤后的基因表达矩阵，用于后续分析。raw_feature_bc_matrix：原始基因表达矩阵。cloupe.cloupe：用于 Loupe Browser 可视化的文件。
4. 结果解读
4.1 结果统计
- 查看网页报告：
打开web_summary.html文件，查看测序统计、细胞统计、比对统计等信息。这些信息可以帮助你评估实验的成功与否。
4.2 细胞计数质控（cell QC）
- 判断单细胞：
Cell Ranger 使用一种改进的算法来识别单细胞。主要步骤包括：- 识别高 RNA 含量细胞：根据 UMI 总数的 cutoff 值，识别高 RNA 含量的细胞。
- 建立背景模型：选择低 UMI 计数的 barcode，建立 RNA 图谱背景模型。
- 区分单细胞和空细胞：将 barcode 的 RNA 图谱与背景模型进行比较，区分包含细胞的 barcode 和空 barcode。
4.3 单细胞亚群分类
-
聚类分析：
使用 t-SNE 或 UMAP 等降维方法对细胞进行聚类分析，识别不同的细胞亚群。 -
差异表达分析：
通过比较不同亚群之间的基因表达差异，找到标记基因。
5. Loupe Browser 可视化
Loupe Browser 是 10x Genomics 提供的可视化工具，用于查看和分析 Cell Ranger 生成的结果文件。
-
安装 Loupe Browser：
wget https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/loupe # 根据操作系统选择合适的版本下载并安装 -
运行 Loupe Browser：
启动 Loupe Browser，加载.cloupe文件，进行可视化分析。 -
可视化功能：
- t-SNE 和 UMAP 图：展示细胞的聚类分布。
- 基因表达热图：展示不同细胞亚群的基因表达情况。
- 差异表达分析：识别不同亚群之间的标记基因。
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5. Loupe Browser 可视化
Loupe Browser 是 10x Genomics 提供的一个交互式数据可视化工具，它允许用户探索和分析由 Cell Ranger 生成的单细胞测序数据。Loupe Browser 提供了丰富的可视化功能，可以帮助用户更好地理解数据。
5.1 安装 Loupe Browser
- 下载：访问 10x Genomics 官方网站 并下载适用于您操作系统的 Loupe Browser 版本。
- 安装：根据下载的安装包进行安装。对于大多数操作系统，这可能涉及解压安装包并运行安装脚本。
5.2 运行 Loupe Browser
- 加载数据：启动 Loupe Browser 后，加载由 Cell Ranger 生成的
.cloupe文件。这个文件包含了单细胞分析的所有必要数据。 - 探索数据：使用 Loupe Browser 的各种工具来探索数据，包括查看基因表达、细胞亚群、以及它们之间的关系。
5.3 可视化功能
Loupe Browser 提供了多种可视化功能，帮助用户理解单细胞数据：
- t-SNE 和 UMAP 图：这些图展示了细胞在低维空间中的分布，有助于识别不同的细胞群和它们之间的关系。
- 基因表达热图：这些热图显示了选定基因在不同细胞群中的表达水平，有助于识别标记基因。
- 差异表达分析：Loupe Browser 允许用户比较不同细胞群之间的基因表达差异，这对于发现特定细胞类型的特征基因非常有用。
- 细胞亚群注释：如果可用，Loupe Browser 还可以提供基于已知数据库的细胞类型注释，帮助用户理解他们的数据在生物学上的含义。
5.4 利用可视化结果
- 识别细胞亚群：通过t-SNE或UMAP图，可以直观地看到不同的细胞亚群。
- 发现差异表达基因：通过差异表达分析，可以找到在不同条件下表达变化的基因。
- 生物学解释：结合基因表达数据和细胞亚群信息，可以对生物学问题进行更深入的解释。
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总结
使用Cell Ranger进行单细胞数据分析是一个多步骤的过程，包括数据转换、质控、生成基因表达矩阵以及结果解读和可视化。以下是整个过程的总结：
-
数据转换 BCL2FASTQ：
- 使用Illumina提供的
bcl2fastq软件将测序仪生成的BCL格式数据转换为FASTQ格式，这是进行下游分析的前提。
- 使用Illumina提供的
-
数据质控：
- 利用FastQC等工具对FASTQ数据进行质控，确保数据质量符合分析要求。
-
生成矩阵 COUNT：
- 使用Cell Ranger软件对原始数据进行比对和定量分析，生成基因表达矩阵。这一步骤包括比对测序数据到参考基因组、进行UMI计数以及生成可用于下游分析的基因表达矩阵。
-
结果解读：
- 分析Cell Ranger生成的统计摘要，包括测序统计、细胞统计和比对统计等信息。
- 进行细胞计数质控（cell QC），以识别和过滤掉低质量的细胞。
-
Loupe Browser 可视化：
- 使用Loupe Browser加载Cell Ranger生成的结果文件（
.cloupe），并进行数据的可视化分析。这包括查看t-SNE和UMAP图、基因表达热图以及进行差异表达分析。
- 使用Loupe Browser加载Cell Ranger生成的结果文件（
单细胞数据分析的重要性
单细胞测序数据分析为我们提供了在单个细胞水平上理解基因表达的能力，这对于揭示细胞异质性、识别新的细胞类型、追踪细胞分化路径以及理解复杂生物过程至关重要。随着技术的进步，单细胞测序数据分析正变得越来越重要，它正在改变我们对生物学和疾病机制的理解。
后续步骤
完成Cell Ranger分析后，研究人员通常会进行更深入的数据分析，包括但不限于：
- 数据预处理：包括归一化、标准化和降维等。
- 聚类分析：识别不同的细胞群和亚群。
- 差异表达分析：找出在不同条件下或不同细胞群中差异表达的基因。
- 轨迹分析：推断细胞分化和发育路径。
- 功能富集分析：理解差异表达基因的生物学意义。
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