MNase-seq

1. MNase-seq 简介

MNase-seq（Micrococcal Nuclease Sequencing，微球菌核酸酶测序）是一种用于研究 染色质结构 和 核小体定位 的高通量测序技术。它利用 微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease, MNase） 的特性，选择性消化裸露的DNA，而保留核小体（nucleosome）包裹的DNA片段。随后，对这些DNA片段进行测序，以分析染色质的构象、核小体占据位置及其调控作用。

---

2. MNase-seq 的原理

MNase-seq 的原理主要基于 MNase 对染色质的选择性降解：

1. MNase 是一种核酸内切酶，具有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶活性：

   • 对游离 DNA（无蛋白结合）高度敏感

     ，可完全降解成小片段。

   • 对核小体保护的 DNA 具有较低的降解能力

     ，因此可用于研究染色质结构。

2. 核小体是 DNA 与组蛋白形成的基本单位，每个核小体约由 147 bp DNA 围绕 组蛋白八聚体（H2A、H2B、H3、H4 各两份） 形成。

3. MNase 消化后，核小体保护的 DNA 片段会被富集，并通过高通量测序（NGS）分析核小体的 定位、间隔、占据密度 等信息。

---

3. MNase-seq 实验流程

(1) 样本制备

• 选择细胞或组织样本（如哺乳动物细胞、酵母、植物等）。

• 交联（可选）：有时会使用 甲醛交联 来稳定染色质结构，特别是在研究动态核小体时。

• 细胞裂解，释放染色质。

(2) 微球菌核酸酶（MNase）消化

• 使用不同浓度的 MNase 处理染色质，以获得不同程度的 DNA 片段化：

  • 短时间消化

    ：保留多核小体片段（如二聚体、三聚体）。

  • 长时间消化

    ：主要获取单个核小体（~147 bp DNA）。

• 终止反应，提取DNA。

(3) DNA 片段纯化

• 使用 酚-氯仿提取 或 磁珠纯化 去除蛋白质等杂质。

• 琼脂糖凝胶电泳

   或 生物分析仪（Bioanalyzer） 检测片段大小（主要分布在 ~147 bp）。

(4) 构建测序文库

• 连接测序接头（Adapter ligation）。

• 选择适当片段大小（~150 bp）。

• 进行 PCR 扩增，富集目的 DNA 片段。

(5) 高通量测序

• 采用 Illumina、Nanopore 或 PacBio 平台进行测序（Illumina 最常用）。

• 生成短读序列（Reads）。

(6) 数据分析

数据分析主要包括：

1. 数据质控（Quality Control, QC）

   • 使用 FastQC 检查测序数据质量。

   • 过滤低质量 reads 和接头污染。

2. 比对到参考基因组

   • 使用 Bowtie2 或 BWA 将 reads 对齐到参考基因组。

   • 过滤多重比对的 reads。

3. 核小体定位分析

   • 计算 核小体占据图谱（nucleosome occupancy map）。

   • 识别 核小体空缺区（nucleosome-free regions, NFRs）。

   • 使用 NucleoATAC、NPS（Nucleosome Positioning Software） 或 iNPS 进行核小体定位预测。

4. 可视化

   • 使用 IGV（Integrative Genomics Viewer） 或 UCSC Genome Browser 查看核小体分布。

   • 使用 DeepTools 绘制 核小体占据热图。

---

4. MNase-seq 数据解读

MNase-seq 主要提供如下信息：

1. 核小体定位（Nucleosome Positioning）

   • 高 MNase 信号区域表示 稳定核小体。

   • 低 MNase 信号区域表示 开放染色质或活跃调控区域（如启动子、增强子）。

2. 染色质可及性（Chromatin Accessibility）

   • 在 活跃基因启动子 处，通常观察到 核小体空缺区（NFR），表明转录因子易于结合。

3. 动态染色质重塑

   • 比较不同条件下（如药物处理前后）MNase-seq 数据，可揭示 核小体重塑（nucleosome remodeling） 机制。

---

5. MNase-seq 与其他染色质研究技术的比较

技术	研究目标	优点	缺点
MNase-seq	核小体定位	高分辨率、可检测核小体稳定性	可能存在 MNase 偏好性
ATAC-seq	染色质可及性	无需交联、快速、适用于小细胞数	不能直接解析核小体精确位置
DNase-seq	开放染色质区域	可检测增强子等调控元件	不能分辨核小体精确结构
ChIP-seq	组蛋白修饰	研究组蛋白修饰模式	依赖抗体质量

---

6. MNase-seq 的局限性

虽然 MNase-seq 是研究核小体结构的重要工具，但仍存在一些限制：

1. 酶切偏好性（Enzyme Bias）

   • MNase 偏向于切割 A/T 富集区域，可能导致某些区域被过度消化或保护不均匀。

2. 不能直接研究染色质调控因子

   • 只能提供核小体定位信息，而不能直接检测 组蛋白修饰 或 转录因子结合（需要结合 ChIP-seq）。

3. 实验条件影响

   • MNase 浓度、消化时间、细胞固定

      等因素会影响核小体占据分析。

---

7. MNase-seq 的应用

MNase-seq 在染色质结构和基因调控研究中具有广泛应用：

1. 核小体定位和基因调控

   • 研究启动子区的核小体组织，揭示转录调控机制。

2. 染色质重塑和表观遗传调控

   • 结合 ChIP-seq，可研究组蛋白修饰如何影响核小体定位。

3. 癌症和疾病研究

   • 发现 肿瘤细胞 染色质异常，揭示表观遗传调控异常导致的疾病。

---

8. 结论

MNase-seq 是研究 核小体组织和染色质结构 的强大工具。它可以提供高分辨率的 核小体定位图谱，帮助解析 基因调控机制，但仍需结合其他技术（如 ATAC-seq、ChIP-seq）以获得更全面的染色质调控信息。

以下是一个MNase-seq 数据分析 流程，涵盖从原始数据质控、比对、去除重复、核小体定位分析到可视化的各个步骤，使用常见的生物信息学工具（如 FastQC、Bowtie2、Samtools、deepTools 等）。

✅ 环境准备

在执行以下代码前，请确保已安装以下工具：

• FastQC

  （数据质控）

• Bowtie2

  （比对工具）

• Samtools

  （BAM 文件处理）

• deepTools

  （核小体定位和可视化）

• bedtools

  （基因组操作）

• IGV

  （可视化）

如果未安装，可使用以下命令安装：

# 以 Ubuntu/Debian 系统为例sudo apt updatesudo apt install fastqc bowtie2 samtools bedtoolspip install deeptools

---

📂 1. 数据质控 (Quality Control)

输入文件

• sample_R1.fastq.gz（MNase-seq 原始数据）
• sample_R2.fastq.gz（双端数据时）

执行 FastQC

mkdir -p QCfastqc sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz -o QC

查看质控报告​​​​​​​

firefox QC/sample_R1_fastqc.html

 

注意：如果存在低质量碱基、接头污染，可以使用 Trim Galore 进行修剪：​​​​​​​

trim_galore --paired sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz -o trimmed/

 

---

🔗 2. 将 Reads 比对至参考基因组

索引参考基因组

假设使用 人类基因组 (hg38)：​​​​​​​

bowtie2-build hg38.fa hg38

进行比对​​​​​​​

bowtie2 -x hg38 -1 sample_R1.fastq.gz -2 sample_R2.fastq.gz \        -S sample.sam --threads 8 --very-sensitive

参数解释：

• -x

  ：基因组索引前缀

• -1/-2

  ：双端测序数据

• --very-sensitive

  ：提高比对准确性

• --threads

  ：多线程加速

将 SAM 转换为 BAM 格式

​​​​​​​

samtools view -Sb sample.sam > sample.bam

 

---

📊 3. 比对结果统计与过滤

统计比对信息​​​​​​​

samtools flagstat sample.bam

 

去除多重比对和低质量比对​​​​​​​

samtools view -b -q 30 sample.bam > sample.q30.bam

参数解释：

• -q 30

  ：只保留 MAPQ ≥ 30（高置信度）的 reads。

去除 PCR 重复​​​​​​​

samtools rmdup sample.q30.bam sample.rmdup.bam

 

排序和建立索引​​​​​​​

samtools sort -o sample.sorted.bam sample.rmdup.bamsamtools index sample.sorted.bam

 

---

📐 4. 核小体占据区域分析

生成 Fragment Length 分布​​​​​​​

bamPEFragmentSize --bam sample.sorted.bam --outFile fragment_length.txt \                  --plotFile fragment_length.png --samplesLabel "MNase-seq"

目的：

• 单核小体 (~147 bp) 是 MNase-seq 的典型片段长度。

• 双核小体 (~300 bp) 也可能存在。

提取单核小体区域 (120-180 bp)​​​​​​​

samtools view -h sample.sorted.bam | \awk '{if($9 >= 120 && $9 <= 180) print $0}' | \samtools view -b - > sample.nucleosome.bam

---

📌 5. 生成核小体占据图谱

生成覆盖度 (bigWig) 文件​​​​​​​

bamCoverage -b sample.nucleosome.bam -o sample.nucleosome.bw \            --binSize 10 --normalizeUsing RPKM

参数解释：

• --binSize 10

  ：窗口大小（10 bp）

• --normalizeUsing RPKM

  ：对覆盖度进行 RPKM 标准化

---

📏 6. 核小体定位 (Peak Calling)

使用 NucleoATAC 进行核小体定位

安装：​​​​​​​

conda install -c bioconda nucleoatac

执行定位：​​​​​​​

nucleoatac run --bam sample.sorted.bam --fasta hg38.fa --out sample_nucleoatac

输出：

• *_nucpos.bed

  ：核小体位置

• *_nfr.bed

  ：核小体空缺区

---

📊 7. 核小体可视化

在 IGV 中查看核小体

1. 下载 IGV：https://software.broadinstitute.org/software/igv/

2. 导入数据：

   • sample.nucleosome.bw

     （核小体覆盖度）

   • *_nucpos.bed

     （核小体定位）

生成热图 (Heatmap)​​​​​​​

computeMatrix reference-point \    --referencePoint TSS \    -b 2000 -a 2000 \    -R genes.bed \    -S sample.nucleosome.bw \    -o matrix.gz
plotHeatmap -m matrix.gz -o nucleosome_heatmap.png

结果：生成的热图直观展示基因启动子周围的核小体分布情况。

---

📚 8. 结果解读

• 核小体密集区域

  ：染色质紧密、基因不易转录。

• 核小体空缺区 (NFR)

  ：开放染色质，利于转录因子结合。

• 核小体定位变异

  ：比较不同条件下的核小体分布，揭示染色质重塑。

---

🧰 9. 批处理脚本

如果需要对多个样本进行批量分析，可使用以下 Shell 脚本：​​​​​​​

#!/bin/bashfor sample in $(ls *.fastq.gz | sed 's/_R[12].fastq.gz//' | uniq); do    echo "Processing: $sample"    fastqc ${sample}_R1.fastq.gz ${sample}_R2.fastq.gz -o QC    bowtie2 -x hg38 -1 ${sample}_R1.fastq.gz -2 ${sample}_R2.fastq.gz \            -S ${sample}.sam --threads 8 --very-sensitive    samtools view -Sb ${sample}.sam | samtools sort -o ${sample}.sorted.bam    samtools rmdup ${sample}.sorted.bam ${sample}.rmdup.bam    bamCoverage -b ${sample}.rmdup.bam -o ${sample}.bw --binSize 10 --normalizeUsing RPKMdone

生信大白记第54记，就到这里，关注我！

下一记，持续更新学习生物信息学的内容！

生信大白记邮箱账号：shengxindabaiji@163.com

生信大白记简书账号：生信大白记

生信大白记CSDN账号：生信大白记

生信大白记微信公众号：生信大白记

加入生信大白记交流群938339543