植物单细胞测序如何做marker基因识别及后续验证？

自2018 年 Science 将单细胞技术评为十大科学突破之首，2019年Nature Methods将单细胞多组学技术评为“年度技术”，单细胞转录组技术快速发展，并衍生出全新的内容。

植物单细胞核转录组测序的研究对象广泛，适用于冻存和难以制备原生质体的组织，抽核降低了细胞类型的偏好性，能够获取更全面的细胞类型，避免了酶消化导致的应激表达。在目前植物单细胞研究应用日趋广泛。

近日，《development》发表的文章中，对于杨树茎尖的发育过程及草本与木本植物的发育模式差异进行了深入探讨，文章展示了结合模式物种进行非模式物种的marker基因识别、细胞亚群分类及marker基因的后续实验验证方法。

研究背景 

植物茎尖分生组织（SAM）负责产生地上部分，营养茎尖的干细胞经过分裂产生过渡细胞，最终分化为侧生器官。但目前对多年生木本植物如杨树( Populus sp . )的茎尖细胞起源和发育轨迹了解不足，仍然缺乏茎尖的高分辨率和细胞类型特异性的基因表达图谱。

近年来，随着单细胞测序技术的不断发展，对植物生长发育过程及机制的研究逐渐增多。研究利用单细胞核转录组测序技术，分析了杂交杨树营养茎尖的转录组，并预测了从SAM发育为新组织过程中的轨迹。首次在单细胞水平上比较了一年生草本植物和多年生木本植物的初生维管发育情况。

研究方法 

从3周龄的体外杂交杨树（Populus tremula×alba）中获得了20个茎尖，并使用10x Genomics Chromium技术进行了高通量微流控单核RNA测序。结合拟南芥数据进行细胞分群与分析方法验证，并利用RNA原位杂交技术进行了marker基因验证。

主要结果  

1、杨树营养茎尖细胞图谱

对测序数据进行处理并进行Seurat聚类，共获得18个clusters。基于拟南芥及杨树中已知的marker基因对其进行注释，共揭示了8种细胞类型：表皮毛(TRI)、叶肉细胞(MC)、表皮细胞(EC)、茎端分生组织细胞(SMC)、增殖细胞(PC)、维管束细胞(VC)、伴胞(CC)和基部分生组织细胞(GMC)。

结果表明，杨树和拟南芥的营养茎尖由高度异质的细胞组成，表明两者的营养茎尖的许多调控机制是保守的。

2.表皮、叶肉和维管组织分化的发育轨迹

研究发现PC群体中含有向表皮（EC）、叶肉( MC )和维管束( VC )细胞分化的细胞。利用Asc-Seurat中将EC（cluster2、8和16）、MC（cluster1）和VC亚群（cluster4、6、10和16）分别与PC亚群（cluster5、11、12）重聚类，最终生成EC、MC和VC及其相应的增殖细胞亚群。并应用Slingshot v.1.8推断表皮、叶肉和维管组织分化的发育轨迹。利用EC、MC和VC的转录特征将增殖细胞进一步细化，为研究杨树SAM干细胞如何分化为茎尖形成的不同新组织铺平了道路。

3.杨树和拟南芥初生维管系统发育的比较

研究比较了拟南芥和杨树的茎尖单细胞数据，发现两物种的维管细胞聚类显示出相似的细胞亚群结构。应用tradeSeq识别发育轨迹。分别从杨树韧皮部、木质部和原形成层的细胞类群中鉴定出576、191和417个DEGs，这些DEGs中大部分也出现在拟南芥中。研究确定了一个和生长素相关的基因LAX2。

为确定哪些基因在两物种的细胞分化过程中表现出相同的表达模式，对发育轨迹的基因表达相关性进行计算，发现韧皮部和木质部发育的常见基因中，分别有51%和60%的基因显著相关，说明这些显著相关的基因功能较为保守。

结果表明，在拟南芥中发现的初生维管形成相关基因在多年生木本植物中是保守的。然而，与维管分化显著相关的基因似乎是杨树特有的。

4.杨树生长素流入载体LAX2-like的研究实验

为验证聚类和注释的准确性，进一步通过RNA原位杂交验证了表皮细胞亚群中的一个marker基因（Potri.014G152000）的表达。同时也通过构建LAX2的启动子融合GUS的转基因株系来评估杨树茎尖维管发育轨迹的准确性。GUS染色实验结果与单细胞数据一致，这些遗传分子实验的结果也证明了作者对细胞聚类和注释以及发育轨迹的准确性。

研究进一步通过CRISPR-Cas9技术构建了杨树LAX2基因的敲除株系，探究了LAX2 - like基因在杨树维管发育过程中的作用。与野生型相比，突变株的茎的直径显著减少，木质部导管较野生型少，次生木质部的发育显著受阻。这表明杨树LAX2 - like基因在促进木质部分化中起着一定作用。

RNA原位杂交和GUS验证

 总 结  

研究基于单细胞核转录组测序技术，绘制了多年生模式物种杨树的营养茎尖基因表达图谱，根据拟时序分析重现了杨树茎尖表皮、叶肉以及维管细胞的发育轨迹。解析一年生草本植物和多年生木本植物初生维管组织形成的发育轨迹的异同。此外，通过比较原形成层和维管形成层的特定转录组数据有助于研究多年生植物从初生到次生生长的过渡过程。

但cluster7、9和14并未注释出明确的细胞类型，其中可能包括尚未在杨树等木本多年生植物中表征的新的或稀有的细胞类型，可能还需要进一步细化亚群来探究这三个未知的亚群。

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参考文献：

Single-nuclei transcriptome analysis of the shoot apex vascular system differentiation in Populus. Development.2022