从头RNASEQ

1.QC质控 步骤与CHIPSEQ相同

2.STAR进行比对

安装

wget https://github.com/alexdobin/STAR/releases/tag/STAR_2.4.2a
tar -xzf STAR_2.4.2a.tar.gz
cd STAR_2.4.2a
# Build STAR
cd source
make STAR

这里是引用

2.1建立STAR索引

建立索引前首先下载参考基因组文件

人类参考基因组网站

https://www.gencodegenes.org/human/

↑下载GTF文件

以及fa文件。
利用wget -c可以无断点下载。
利用wget -i 下载.txt文件
鼠的基因组同上。

• hg19的基因组下载时下载fasta文件时，下下面两个文件
  并将transcript文件放到starindex文件夹下，为后面rsem建索引做准备。

建立索引时

 STAR  --runMode genomeGenerate --runThreadN 16 --genomeDir /Data/wu_lab/reference/starindex/mouse/ --genomeFastaFiles /Data/wu_lab/reference/starindex/mouse/GRCm39.genome.fa --sjdbGTFfile /Data/wu_lab/reference/starindex/mouse/gencode.vM27.annotation.gtf

显示successfully即为成功

2.2使用STAR

 STAR --runThreadN 16 --runMode alignReads --readFilesCommand zcat --quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts --outSAMunmapped None --genomeDir /Data/wu_lab/reference/starindex/mouse/ --readFilesIn /Data/wu_lab/yuanye/projects/RNAseq/daizhongye/2021_8_12/data/xxxxxx.fq.gz --outFileNamePrefix xxxxxx

比对过程：
比对结果文件：

双端比对时 输入文件该文${i}_1.fq.gz和 ${i}_2.fq.gz

其中

EZH2-RA3h-rep2Log.final.out

文件里保存的是比对率等信息，可以查看比对统计信息。

以"Aligned.sortedByCoord.out.bam"为后缀的BAM文件中，reads比对到的位置是基因组位置。
以"Aligned.toTranscriptome.out.bam"为后缀的BAM文件中，reads比对到的位置是转录本位置。

https://www.bioinfo-scrounger.com/archives/288/

3.rsem转录本定量

安装

 conda install -c bioconda rsem

3.1 建索引

(RNASEQ) wu_lab@bio:~/reference/starindex/mouse$ rsem-prepare-reference --gtf mm9.gtf --STAR GRCm39.genome.fa -p 30 /Data/wu_lab/reference/mousersemindex/mouse/

建立过程及结果显示

3.2 运行rsem

(RNASEQ) wu_lab@bio:~/yuanye/projects/RNAseq/daizhongye/2021_8_12/rsem/E14_Scr_SL_1$ rsem-calculate-expression   -no-bam-output  --alignments -p 30 /Data/wu_lab/yuanye/projects/RNAseq/daizhongye/2021_8_12/STAR/xxxxxx/xxxxxAligned.toTranscriptome.out.bam  /Data/wu_lab/reference/mousersemindex/mouse/  xxxx

运行过程

双端比对时

rsem-calculate-expression --paired-end -no-bam-output --alignments -p 8 input_Aligned.toTranscriptome.out.bam reference_name out_prefix