EMSA实验技术介绍

EMSA实验技术介绍

一、技术概述

凝胶阻滞或电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一种研究DNA结合蛋白质和相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。在非变性的聚丙烯凝胶电泳中，蛋白质与核酸分子结合后会增加其相对分子质量，导致核酸片段的迁移率降低。因此，没有结合蛋白质的核酸片段迁移得快，而与蛋白质结合形成的复合物迁移得慢，从而可以通过电泳条带的滞后现象来检测蛋白质与核酸的结合情况。

‌二、实验目的

本实验利用生物素标记的DNA探针与样本蛋白结合，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳

后结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢；从而判断该

DNA序列是否与蛋白结合。

三、实验流程

（一）蛋白提取

1. 取组织样品 0.5g，液氮充分研磨;
2. 加入 200 μL 预冷裂解液，2μL PMSF，2μL Protease inhibitor cocktail和 2 μL DTT，4℃旋转裂解 20 分钟；4℃，16,000 g 离心 10 分钟，弃沉淀，上清为提取液；
3. BCA 试剂盒测定蛋白质浓度；
4. 稀释至20ug/ul，液氮速冻后，-80℃暂时保存。

（二）DNA-EMSA 结合反应：

1. 按如下表配制反应体系：

组分	终含量	阴性对照	实验组1	实验组2	实验组3	实验组4	实验组5	突 变 型 冷 竞争反应	野生型冷竞争反应
10×结合反应液	1×	2ul	2ul	2ul	2ul	2ul	2ul	2ul	2ul
细胞核提取物	——	0	2.5ug	5ug	10ug	15ug	20ug	20ug	20ug
Poly(dI:dC)（1 µg /µL)	1 µg	1ul	1ul	1ul	1ul	1ul	1ul	1ul	1ul
生物素标记的探针（20 fmol/ul)	20 fmol	1ul	1ul	1ul	1ul	1ul	1ul	1ul	1ul
竞争性探针（野生）(4pmol/ul)	4pmol	——	——	——	——	——	——	——	1ul
竞争性探针（突变）(4pmol/ul)	4pmol	——	——	——	——	——	——	1ul	——
补充水至：	——	20	20	20	20	20	20	20	20

1. 混匀后在 PCR 仪上37℃反应 20 分钟，让冷探针优先反应；
2. 然后加入标记好的探针，混匀，在 PCR 仪上 37℃反应 20 分钟。

（三）电泳及电转移

1. 加入5 ul Loading buffer（5×），混匀后立即上样；
2. 用 0.5×TBE 作为电泳液。按照 150V电压预电泳 60 分钟；
3. 将带正电的尼龙膜放入 0.5×TBE 中平衡 10min。待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。转膜缓冲液为预冷的 0.5×TBE，300mA 转印 30分钟；

（四）紫外交联

1、于254 nm 紫外灯进行交联 20 分钟；

（五）化学发光反应

1. 交联好的尼龙膜加入适量封闭液，于摇床上孵育20 分钟（65转/min）；
2. 去掉封闭液，加入按1:3000稀释Streptavidin-HRP于摇床上孵育30 分钟（65转/min）；
3. 去掉Streptavidin-HRP，并用10ml的洗涤液漂洗3遍，每遍于摇床上漂洗5min(75转/min);
4. 将膜从洗涤液中取出，稍微吸干上面的液体，放入化学发光仪的载物台上，加入ECL工作液完全覆盖尼龙膜，室温静置2-3 分钟;然后进行信号采集。

四、技术优势

✅ 操作简单：EMSA实验相对容易掌握，实验条件要求不高
✅ 标记探针稳定性高：生物素标记的探针比同位素标记更稳定、准确
✅ 检测范围广：可检测不同大小的核酸分子，并确定蛋白结合的具体序列位置
✅ 多蛋白检测：在合适的条件下，可以在单个反应体系中检测不同蛋白与不同核酸分子之间的结合情况

• 适用范围

1️⃣ DNA结合蛋白的研究‌

2️⃣ RNA结合蛋白的研究

3️⃣ ‌蛋白质与核酸的相互作用‌

六、代表性实验结果