细胞工程-6-原生质体分离核体细胞杂交

 

目录

第一节 原生质体分离

分离的程序：

材料选择：

二、原生质体的纯化

三、原生质体活力测定

影响原生质体数量和活力的因素

第二节 原生质体培养

一、原生质体培养的研究进展

二、原生质体培养

管理：

影响因素：

第三节 植物体细胞杂交技术

 三、原生质体的融合类型

四、杂种细胞的选择系统

五、体细胞杂种植株的鉴定

思考题

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原生质体指除去细胞壁之后裸漏具有生活力的原生质团。

特点：

• 具有全能性，全套遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化成完整植株。
• 吸收和分泌能力较高，易于摄入外源遗传物质、细胞器、细菌、病毒等；易于吸收氧、养分；细胞膜的透过性增强，利于细胞内产物的分泌。
• 一定条件下诱导细胞融合，形成杂种细胞。
• 稳定性差，失去细胞壁的保护，稳定性较差，易于受到渗透压等条件变化影响。

研究意义：

• 建立单细胞无性系：突变体筛选、刺激代谢产物生产、人工种子。
• 为细胞融合奠定基础。
• 遗传工程的受体材料。
• 原生质体是多种理论研究的实验系统。

PS：

• 原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。
• PI染色：细胞核DNA染色。

几个概念：

• 原生质球：制备原生质体时，有残存的细胞壁，但仍是球形的细胞。
• 亚原生质体：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体，它可以具有细胞核或没有细胞核。
• 核质体（nuckearplast）：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。
• 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
• 微小原生质体（miniprotoplast）：由于原生质体膜和薄层细胞质所包围的细胞核或部分染色体的小原生质体。含部分染色体的微小原生质体一般来源于细胞核正处于分裂过程的细胞。

第一节 原生质体分离

分离方法：机械法、酶解法

机械法：将细胞放入高渗糖溶液中预处理，待细胞发生质壁分离后，原生质体收缩成球形后，借助利器（如刀等）或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。

机械法分离的特点：

• 原生质体产量低；
• 只能用于高度液泡化的贮藏组织，如萝卜的根、洋葱的鳞片、甜菜的根和黄瓜的中皮层等。难以从分生组织中分离得到原生质体；
• 可能适当地排除外加酶对原生质体的结构和代谢活性的有害因素。

酶解法：将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液作用下细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。

分离的程序：

• 材料选择
• 材料预处理
• 酶解
• 原生质体的纯化
• 原生质体活力检测

材料选择：

• 具有良好形态发生潜力；
• 量大、质地均匀；
• 经酶解后原生质体稳定性好、活性高

常用材料：

✓植物组织或器官：幼叶、胚轴、子叶；

✓无菌苗：茎、叶；

✓培养的细胞或组织：愈伤组织、胚状体和悬浮细胞

材料预处理目的：改变细胞和细胞壁的生理状态，提高酶解效率，增加细胞膜的强度，减少原生质体的损伤，使某些难于分裂的细胞进行分裂，提高原生质体的活力和分裂频率。

方法：

低温处理：龙胆试管苗叶片在4°C下处理后原生质体才能分裂。

暗处理：将豌豆枝条在暗中放置30h，叶片原生质体的活力提高，能持续分裂。

预培养：胚性愈伤核细胞悬浮系在新鲜培养基上培养5-7d再进行分离原生质体；叶片撕去下表皮，在愈伤诱导培养基上培养1周，可提高原生质体的分裂频率。

预质壁分离：将材料放到与酶液中糖浓度相同的糖溶液中预培养1h，使质壁分离，再进行酶解处理。叶片萎蔫处理：将叶片置于日光或灯光下2-8h使叶片萎蔫，有利于撕去下表皮。

酶解：植物细胞壁：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶。

常用

• ⚫果胶酶/离析酶
• ⚫纤维素酶
• ⚫半纤维素酶
• ⚫崩溃酶：分离培养细胞及根尖细胞。
• ⚫蜗牛酶分离花粉母细胞、四分体细胞
• ⚫胼胝质酶：花粉小孢子

渗透压状态：等渗或比细胞内渗透压略高，便于维持细胞正常渗透压。

作用：代替细胞壁对原生质体起到保护作用，使释放的原生质体保持活力和膜的稳定性。

糖醇类：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、半乳糖和木糖醇等等。

使用浓度：0.2～0.8mol/L，使原生质体处于一个等渗的环境中。

质膜稳定剂：CaCl2（0.7～