qPCR与新冠病毒核酸检测

qPCR与新冠病毒核酸检测

这篇文章简单记录一下qPCR核酸定量的原理以及它在新型冠状病毒检测中的应用，分享给身边好奇核酸检测的朋友，参考视频链接：https://www.bilibili.com/video/BV1454y1Q7U2/?spm_id_from=333.788.videocard.0

1. 荧光定量PCR

关于荧光定量PCR基本概念（基线、荧光阈值、CT值、扩增曲线、熔解曲线），

基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。

荧光域值（threshold）的设定 ：一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。

CT值 ：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
扩增曲线
PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线

判断曲线是否良好的指标主要有几个方面：

​ 1、曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。

​ 2、曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。

​ 3、标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。

​ 4、各管的扩增曲线平行性好，表明个反应罐的扩增效率相近。

溶解曲线

对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。

1.1 荧光定量PCR与常规PCR

qPCR(quantitative PCR)：利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，并进行定量分析。
常规PCR：对PCR扩增的终产物进行定量和定性的分析，无法对扩增反应实时监测。

1.2 荧光定量PCR如何监测产物量变化

如何实现监控信号：
在PCR体系中添加某种可发光物质，使用信号检测器检测
1） DNA嵌合型分子
sybr green：非特异性结合到DNA双链，产生荧光信号–反应体系内双链DNA浓度越高，荧光信号越强
2） 荧光标记的寡核酸序列
TaqMan 探针：探针5’端存在荧光基团，3’端存在猝灭基团，探针完整存在时不会发出荧光。当PCR反应体系中，探针特异性结合到DNA模版链，在DNA复制过程中，由于DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，可以将探针从模版上切割下来，使荧光基团与猝灭基团分离，从而产生荧光。反应体系内，TaqMan探针结合的目标序列越多，荧光信号越强。

	SYBR Green染料法	Taqman 探针法
结构	嵌合型核酸染料	5’ R — Q3’
优势	成本低；有熔解曲线生成	特异性高；低丰度基因定量可信度高
劣势	特异性较 Taqman 低	成本高；引物二聚体的形成，无法直观判定
应用	SNP分型、表达定量分析、基因突变检测、病原菌检测	病毒检测、病毒载量检测、基因分型、基因突变检测、SNP分型、表达量分析等

1.3 qPCR的扩增曲线

从**“qPCR的扩增曲线”**这张图就可以看到，随着循环数的增加，荧光信号强度逐渐增加

• 基线期：没有明显的荧光信号
• 指数扩增期
• 线性扩增期
• 平台期（酶活性降低，dNTP被消耗尽）

图1.qPCR的扩增曲线

1.4 绘制标准曲线

梯度稀释的标准品作为PCR反应的底物，做出其qPCR的扩增曲线如下图。
**1）设定荧光阈值：**荧光阈值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍（荧光阈值要设定在PCR扩增的指数期，下面图中的红线就是荧光阈值啦）。
**2）获得Ct值：**qPCR的扩增曲线与荧光阈值的交点，其对应的横坐标（PCR循环数）就是该曲线的Ct值。（图中黑色虚线箭头对应的值）

图2.梯度稀释的标准品做qPCR的扩增曲线

3）做出标准曲线方程

logXo = logM - Ct·log(1+En)（logXo 与 Ct 存在线性关系，为一元一次方程）

• Xo为底物浓度（变量）
• logM（常量）
• Ct 为荧光阈值与曲线交点对应的循环数（变量）
• En为扩增效率（常量）

由于标准曲线绘制过程中，logXo 为已知量（因为标准品的Xo已知），Ct值从图2中获得，即可推断得logM和En，获得类似如下形式的方程式。

图3. logXo = logM - Ct·log(1+En)

1.5 获得待测样本的核酸量

重复“绘制标准曲线”的实验步骤，做出待测样本的“qPCR的扩增曲线”，通过设定荧光阈值获得Ct值带入标准曲线方程logXo = logM - Ct·log(1+En)，Xo即为待测样本的核酸量。

2. 新冠病毒核酸检测（RT-PCR）

病毒的遗传物质是RNA，我们将病毒的RNA逆转录为DNA，然后在DNA的基础上做qPCR的 定量实验，根据Ct值的大小判断阴阳性。没错，你没有看错，我们是通过 “定量实验” 来判断待测样本中是否含有 “新冠病毒的遗传物质”。
不过，下面我的文字会很啰嗦，不如视频看着舒服，如果视频不理解再参考我的文字吧～视频链接在这里：
https://www.bilibili.com/video/BV1454y1Q7U2/?spm_id_from=333.788.videocard.0

RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction）逆转录-聚合酶链式反应
包括以下几个步骤：

采集样本 --> 提取RNA–> RT成cDNA --> PCR扩增 --> 结果分析

2.1 采集样本

上呼吸道：咽拭子、鼻拭子
下呼吸道：痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液
采集后低温封存，尽快检测

2.2 提取RNA

常用方法：Trizol法、离心柱法、磁珠法
这里只记录Trizol法
1）Trizol 裂解
病毒的遗传物质为RNA，常常和蛋白质包裹在一起形成拟核。
Trizol的主要成分是苯酚，加入苯酚能够裂解病毒的蛋白质成分，将RNA从病毒中游离出来。
2）氯仿抽提
氯仿使蛋白质变性沉淀，同时氯仿是有机溶剂，苯酚易溶于氯仿中，而RNA易溶于水却不溶于有机溶剂。
经过离心，RNA存在于上层水相中，从而将RNA与蛋白质分离并抽提到水相。移液管将上层水相吸取到另一个干净的离心管中。
3）异丙醇沉淀
异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使RNA聚集而发生沉淀，因此，在离心管中加入异丙醇并离心，获得RNA沉淀。
4）乙醇洗涤
RNA不溶于乙醇，而残留的异丙醇和杂质可以溶于乙醇。因此乙醇洗涤后离心并弃去清夜，达到提纯RNA的目的。
5）晾干
6）DEPC水溶解
DEPC为焦碳酸二乙酯，能够破坏RNase的活性（RNA容易降解，因为降解RNA的酶RNase无处不在）
使用DEPC水溶解RNA，能够保持RNA的完整性

2.3 逆转录获得cDNA

反应体系需要加入 oligo(dT)作为逆转录引物（因为病毒RNA3’端存在polyA尾巴）、逆转录酶、dNTP
根据碱基互补配对原则，逆转录酶以RNA为模版沿着5’到3’端合成碱基互补的DNA链（即cDNA）

2.4 qPCR扩增

这里采用的是探针法qPCR（👆上面1.2中提到的方法），即以cDNA某一高度保守基因序列区为检测靶标，通过PCR扩增，使这段靶标数量呈指数级增加。扩增的同时，产生强度与靶标数量对应的荧光信号，通过检测荧光信号来确定样本中是否含有病毒核酸。

2.5 结果分析

判断样品中是否含有新冠病毒的遗传物质是一项定性实验，因此结果分析时并不需要获得准确的核酸含量（也就省略掉制作标准曲线的步骤啦）。因此在实践过程中，便根据经验将Ct值大于40和没有Ct值被判断为阴性。

**设定荧光阈值：**以第3到第15个循环的荧光信号强度的标准偏差的十倍设定为荧光信号的阈值
**获得Ct值：**荧光阈值线与扩增曲线产生交点，交点对应的横坐标为Ct值（Ct值的含义代表荧光信号强度达到阈值时所经历的PCR循环数）

结果分析

阴性情况：
不存在Ct值：

不存在Ct值

Ct值>40

Ct值>40

阳性情况：
Ct值<37

Ct值<37

可疑情况：
37<Ct值<40（建议重复实验）