AZD1152联合TTFields抑制原发性和复发性胶质母细胞瘤

AbMole（https://www.abmole.cn/）精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。

我们在新胶质母细胞瘤（ndGBM）和复发性胶质母细胞瘤（rGBM）的原代培养中测试了TTFields与极光激酶B抑制剂AZD1152的组合。

滴定每个细胞系的AZD1152浓度，5-30 nM单独使用或与TTFields一起使用（均方根为1.6 V/cm;200 kHz），使用inovitro™系统处理72小时。常规和共聚焦激光显微镜观察细胞形态变化。细胞毒性作用通过细胞活力测定测定。

ndGBM和rGBM原代培养中p53突变状态、倍性、EGFR表达和MGMT启动子甲基化状态存在差异。不过，在所有原代培养中，TTFields单独处理后发现了显著的细胞毒作用，在除一个外的所有组别中，也观察到单独使用AZD1152处理后的显著作用。

此外，在所有原代培养中，联合处理具有最明显的细胞毒作用，同时还具有形态学变化。与单独处理相比，TTFields和AZD1152联合导致ndGBM和rGBM细胞数量显著减少。

AZD1152 （Abmole，M1663，纯度>99%）是一种高度选择性的Aurora B抑制剂，IC50为0.37 nM，作用于Aurora B比作用于Aurora A选择性高100倍左右。

为了检查当AZD1152和TTFields联合使用时，增强的抗肿瘤作用是否独立于p53发生，我们最初使用了p53野生型，长期建立的胶质瘤细胞系U87-MG及其稳定的p53缺陷对应物U87-MGshp53。

U87-MG被证明对单独使用AZD1152治疗高度敏感，其半最大抑制浓度（IC50）约为25 nM（图1A）。单独对TTFields应用（200 kHz, 1.6 V/cm RMS） 72小时的响应导致细胞数量减少49.0%（±2.8%），与之前的报道相似。与p53野生型U87-MG细胞系相比，p53缺陷U87-MGshp53细胞系对AZD1152治疗的敏感性较低，IC50约为50 nM。同样，与p53野生型U87-MG相比，单独应用TTFields导致U87-MGshp53细胞数量减少40.5%（±10.6%）。

与单独使用AZD1152相比，TTFields和AZD1152联合导致U87-MG和U87-MGshp53细胞数量减少（图1A）。虽然U87和U87- mgshp53细胞系之间存在差异，但我们进行了显著性检验，但无论是单独使用AZD1152还是联合使用TTFields，都无法证实统计学上的显著差异。

此外，随着AZD1152浓度的升高，细胞形态发生变化。当AZD1152和TTFields合并时，这些增强了（图1B）。用结晶紫染色的U87-MG和U87-MGshp53细胞的显微镜图像显示，TTFields应用后多核细胞数量略有增加（图1B，第一排）。与单独使用AZD1152（25 nM）处理的细胞相比，暴露于TTFields和低浓度AZD1152（25 nM）处理的U87-MG和U87-MGshp53细胞中观察到更多的多核细胞（用黑色箭头标记）（图1B，第二行）。用TTFields和高剂量AZD1152 （50-100 nM）处理的细胞显示固缩率增加（用蓝色箭头标记）（图1B，第三和第四行）。

最初，研究了原发性胶质母细胞瘤培养物对单独使用AZD1152的反应。细胞对AZD1152治疗表现出不同的敏感性，不管它们的p53状态如何，也不管它们是从ndGBM或rGBM样本中建立的（图2A）。

HT18584 （ndGBM, p53mut）和HT18816 （rGBM, p53wt）细胞表现出高敏感性，IC50在14 nM和18 nM左右，HT16360-1 （rGBM, p53wt）和HT12347 （ndGBM, p53mut）细胞不太敏感，IC50在50 nM和75 nM左右。HT18328-3 （rGBM, p53wt）的IC50在30 nM左右。

此外，增加AZD1152浓度只导致p53突变ndGBM培养物HT12347 （20 nM: 1.1×，50 nM: 0.9×）和HT18584 （20 nM: 0.6×，50 nM: 0.8×）中p53的轻微变化或轻微下降（图2B）。然而，p53野生型rGBM培养物要么表达量增加（HT16360-1, 30 nM: 2.4×，100 nM: 3.2×），要么完全无p53表达（HT18816和HT18328-3）。

为了研究AZD1152和TTFields联合使用增强原发性胶质母细胞瘤培养的抗肿瘤作用，进行了细胞活力测定（图3）。因此，原发性胶质母细胞瘤培养物和U87-MG对单独TTFields治疗（200 kHz）的反应相似，细胞数量减少到中位数49.6-58.8%。HT18584 （ndGBM, p53mut）是一个例外，它的抗性更强，细胞数量的中位数仅为79.2%（44.1-94.3%）。此外，HT18328-3 （rGBM, p53wt）在细胞减少方面表现出高变异性，从14.6%到88.3%（中位数为56.7%）。

因此，对于这两种原发性胶质母细胞瘤培养物，选择的AZD1152浓度可将细胞数量降低至50%活细胞的中位数（HT18584 （ndGBM, p53mut）: 20 nM AZD1152时为49.8%，HT18328-3 （rGBM, p53wt）: 52.5%，AZD1152 15 nM）。对于其他原发性胶质母细胞瘤培养物和U87-MG，使用AZD1152浓度可导致活细胞数量减少到75%（68.3-80.6%）的中位数。

这些低有效剂量的AZD1152的选择考虑了潜在的转化，以降低毒性风险。此外，预计与TTFields联合使用时，即使低有效剂量的AZD1152也会导致细胞毒性作用的增加。与TTFields单独处理相比，AZD1152和TTFields联合处理的抗肿瘤效果显著增强，U87-MG细胞的细胞数量中位数减少57.8%至40.4%，在所有原发胶质母细胞瘤培养物中（59.6-79.2%至26.9-44.1%），无论它们的p53状态如何，也无论它们是从ndGBM或rGBM组织样本中建立的。

由于使用TTFields和Aurora B激酶抑制剂AZD1152会导致有分裂和多倍体受损，使用碘化丙酸染色对处理过的U87-MG和原发胶质母细胞瘤细胞培养物进一步检测DNA含量（图5）。

在U87-MG和ndGBM细胞培养物HT12347（ndGBM, p53mut）和HT18584（ndGBM, p53mut）中，与对照组或单独TTFields处理相比，AZD1152和TTFields同时处理显著增加了DNA含量为4n和>4n的细胞百分比，而2n DNA含量的细胞百分比显著降低。

与对照组相比，单独使用AZD1152也观察到类似的效果。相比之下，rGBM细胞培养则表现出一些特征：HT16360-1（rGBM, p53wt）和ht18338 -3（rGBM, p53wt）在未处理状态下DNA含量为2n的细胞比例非常低（HT16360-1: 6.4%±1.7%;HT18328-3: 10.1%±2.2%），表明这些主要是四倍体细胞培养物。在HT18328-3（rGBM, p53wt）中，与对照组（28.4%±2.4%）和单独TTFields处理（36.6%±6.0%）相比，AZD1152和TTFields联合处理显著增加了>4n DNA含量的细胞比例（48.5%±4.1%），而4n DNA含量的细胞比例显著降低（45.5%±3.4% vs 61.4%±2.3%和53.5%±6.2%）。

对于HT16360-1（rGBM, p53wt），仅联合处理有相似的显著效果（4n: 46.6%±5.5%;>4n: 45.3%±7.5%）与对照组（4n: 53.5%±4.1%，p < 0.001;>4n: 37.2%±3.6%），但与单纯TTFields比较差异则无统计学意义（4n: 48.2%±9.0%;>4n: 40.5%±7.2%）。HT18816（rGBM, p53wt）则表现出非常稳定的2n DNA含量，无论是单一处理（5 nM AZD1152: 79.0%±2.4%;TTFields: 77.5%±2.4%），伴发治疗（76.9%±6.1%）。

鸣谢：AbMole官网 | 抑制剂,激动剂,化合物库 | 美国抑制剂领导品牌

Dietmar Krex, et al. Int J Mol Sci. 2023 Mar 6;24(5):5016.