第四代测序（纳米孔测序）有望全面代替边合成边测序吗？

第四代测序（纳米孔测序）有望全面代替边合成边测序吗？

考量一种测序技术主要有以下几个参数：通量，读长，准确度，单位成本。而单位成本一般可以简单认为和通量成反比，所以简单点就直接考虑前三个因素就行了。

其中读长和准确度都是越长越准确越好，但通量就要看情况了，Sanger测序之所以还在用，一方面是其读长较NGS长，准确度好，另一方面也是因为其通量低，操作简单快速成本低，这使得Sanger测序在某些应用上有其特有的优势，试想某个研究项目中我只想知道某个300bp的外显子的序列，难道还非得用NGS去测吗？当然如果有一天NGS发展到测完整个exome的成本、时间、准确度都比Sanger测一个外显子还有优势的时候，估计Sanger测序也就没人用了。

纳米孔测序也同理，包括PacBio的单分子测序（还有Helicos，不过貌似破产了），这些单分子测序目前最大的优势是读长很长（Helicos除外，难怪破产orz），但通病是通量低、准确度低（注意这几个平台的测序错误与NGS的不太一样，其测序错误都是随机的，也就是说理论上可以通过循环多测几次来矫正，所以准确度低从根本上来说是通量低）。从这个角度看，如果单分子测序的通量能够跟上NGS，那全面取代NGS是早晚的事；如果不行，那只会在某些需要通量不高的应用中逐渐取代NGS，而对于诸如肿瘤这种需要极高通量的somatic测序项目要取代NGS则不太可能（除非通量跟上去）。

 

先等技术可靠了再说吧。听说纳米孔的错误率暂时还无法直视。

纳米孔无法象PacBio那样通过循环来解决错误率，所以错误率目前还是纳米孔的死穴

 

纳米孔单分子测序（更倾向于被称为第三代测序技术）理论很美好，现实还需努力。
纳米孔测序相对SBS的主要的优势：
首先速度快，最快24小时完成样品建库到测序数据收集，碱基读取速度即酶自身的合成速度。
其次单read读长超长，读长可超过10K，方便数据组装。
然后文库构建简单，无需PCR，避免了建库过程中可能引入的错误，得到的是最原始的DNA序列信息。
然而，目前这些优势实现的还不太顺利。
现在二代测序技术相对成熟，巨头公司还在不断升级自家的测序平台，推出性价比更高功能更强的仪器，三代测序公司也在为了更好的实现其理论描述的种种优势继续研发。

如果三代测序技术真的实现了它描述的这些优势（医疗检测急需啊），完全替代二代测序是肯定的。

 

短期内，干的活不一样，互相不能替代。

1. Nanopore Sequencing测得长，但是错误率也高。错误率高可以慢慢降低，但是有一个问题是短时间内解 决不了的，就是建库的时候，如果建库长度长，那么定量就会有很大bias。所以，所谓4代测序，现在定性 目标是可以达到的，定量还差一些。

2.二代测序定量一般很准，当然也有很多bias，但是有一套成熟的流程支撑。

长期来看， 如果建库，测序，分析整个水平都提升上来，价格再降下去的话，二代市场会挤压很多。但可能都是5到10 年以后的事情了。

开个脑洞， 最理想的状态下，是1个活体细胞，扔到Nanopore里面，里面所有的DNA，RNA，蛋白质全部定量，全 部测序出来。

 

作者：Sang
链接：https://www.zhihu.com/question/26491456/answer/62184494
来源：知乎
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更新

Nat Biotech 发表的纳米孔测序完成人类基因组组装的新成果有哪些突破？该技术还有哪些优化空间？​www.zhihu.com

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实验室有几个纳米孔,也做了很多测试,确实相对于二代的仪器来说,测序结果很糟糕,往往不能作为标准性的数据。

优点在于测序速度很快,而且可以做实时的分析,一边测序一边分析结果就可以处理出来。但准确度无法和二代相比,误差很大。

不过牛津一直在更新芯片和技术,准确度的问题也一直在变好。我比较相信还是有很大的发展空间。

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更新最近进展

首先,纳米孔的测序精度已经有大幅提高,从大概80%提高到98%左右,虽然和二代相比还是有差距,但是可以通过后续的分析进行改进,现在已有很多算法通过对比read之间的差异,对read进行矫正,提高测序精度,可以达到99.5%,现在广泛的做法,就是结合二代和纳米孔技术,整体提高测序能力

其次,纳米孔长read相较illumia的短read来说,其作用大很多,可以用来检测基因组的重复区域,以及肿瘤基因组的复杂重组问题,而且对于基因组拼接也有很大帮助

另外,现在纳米孔可以用于RNA测序,能够直接测序出完整的转录本,这是二代无法比拟的

最后,MinION太便携了,口袋里一放,就带走了,非洲埃博拉肆虐的时候,伯明翰的Nick Loman直接带着它去非洲测序分析,大大降低了时间成本

 

下个月10号PacBio来我们学校做报告兼演示，可能还有上机，回来了向大家报告。

由于我自己不是做基因 组的，有错误的地方请大家指正。

12/10/2014

听完报告回来了。这个是这次报告的链接PacBio Workshop, December 10, 2014

第一位是PacBio的科学家，他们的技术称做Single Molecular in Real Time(SMRT)，几个要点

1.不需要PCR，直接测序单个DNA分子

2.读长很长，在10kb级别甚至更高

3.Contig的数量大幅下降（可以到只有一个），小型基因组可以做到封闭（这个有什么术语吗？）。

4.测序速度快，1-4小时

第二位是南边MayoClinic的科学家，现在明大的样品是送到那里去测

1.他提高了价格，大概是$342/Cell，这里的Cell就是SMRT Cell，相当于illumina的lane.

2.明大的样品要Fedex过去。

3.机器好大。。。

第三位是明大Super Computere Institute（MSI）的。主要介绍了MSI提供的分析工具，基本上半自动 了。这部分这周五有上机，回来我再补充。

不知道谁提到了一点，虽然illumina的读长短，但准确度略高于SMRT。所以也有人讲SMRT和illumina测 序结合起来组装基因组。

之后的几位都是明大的教授了，大家基本上都是说SMRT在自己研究领域的作用。超长的读长可以显著降低 基因组组装时的不确定性，应该是未来的方向。但目前SMRT的通量还不高，一个Cell只能够组装微生物的 基因组，但是PacBio也在实验新的试剂，可以提高通量。

大致就是这样了哈。过两天MSI会把PPT贴出来，大家想看我就传上来哈。 回到问题上，我觉的目前PacBio已经可以替代小型基因组的测序了，至少可以配合illumina一起使用。但 是像我这样做amplicon测序的，还是illumina MiSeq更合适

 

• Contig的数量大幅下降（可以到只有一个），小型基因组可以做到封闭。”我猜这里的封闭应该指的是成环吧……细菌基因组多半是环状的，所以可以用组装好的序列和整个基因组比，然后看能比上，就可以切掉重复部分，成环。是这意思吧

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• 

  ErinCheung回复Lethe Bai10-17

  是的，一个完整的环，one chromosome，one contig

 

 

未来三代测序不会完全取代二代测序。
即使是现在的二代测序也没有完全取代一代测序，对于<100kb的片段，我们依然使用Sanger法的一代测序方案。
二代高通量测序和三代单分子测序的区别可以用“吃米饭”和“吃面条”来形容。
二代高通量技术像吃米饭，一粒粒的很短，但是同时能吃很多粒；三代测序技术原理有点象在吃面条，抓住一头一吸，从头读到尾，一次只能吃一根。（实际肯定不只一根，但比二代要少）
有些研究比如基因组测序就是越长越好，对于读长的要求高于对通量的要求，肯定是“吃面条”的三代更合适。而有些研究则更适合吃米饭，比如免疫组库的测序就需要对几十万个T细胞或B细胞受体进行检测，这种情况肯定是“吃米饭”的现有二代测序更好。
所有究竟使用哪种测序技术需要依需求而定。
二代示意图

三代示意图

其实以前我比较推崇的一种测序方式原理介于二代和三代之间，不打断长序列，而是利用探针进行分段同时测序，既满足高通量也满足长度长的需求

当年隔壁实验室做的就是这个课题的，他们是通过TEM的电子束打穿一个薄膜而制作相应的器件。平时聊天时也讨论过这个技术的可能性，好像加州有几个startup也在试图做这个。
目前的瓶颈好像在于如何准确的控制一条DNA链稳定通过这个纳米孔，并且能够得到可分辨的准确信号。但是不仅理论上还有很多问题没有解决(所以我同届的一个同学目前还没有毕业…)，并且在纳米量级的器件工艺整体还在发展中。我的理解就是，能把DNA链牵着穿过那个小孔的“镊子”现在还造不了那么小，现在用来观察每个碱基对的“放大镜”还看不了那么清楚。这好像也是整个纳米科技行业目前所面临的问题。
 

Sanger法作为标准，磷酸法胜在大通量、平台化，纳米孔还有很多问题，比如制样困难，但他是单分子分析，而且无损、无需扩增，可以做逆向遗传学，体积也可以减小，甚至有希望便携化（现在的概念产品体积就已经可以做到揣着走了）。

相比之下，其实耗样少不算四代测序的核心优势，现在基于Sanger法的微型微量测序技术也有，比如UCSD做过一个在聚酯塑料片上的，Sanger半自动测序，很巧妙也很小。

 

这两年我们组倒是为单分子实时测序做了一点点贡献（测了10来个细菌，1个真菌），感觉吧，拿来做重测序肯定是没必要的，de novo效果还不错。成本再降点，市场应该比现在大，但应该不会全面霸占市场，针对不同的项目，对数据的要求，成本的控制均是不一样的。只是多一个选择吧。

 

是极大可能的，现在还受限于硅制作工艺决定了通量。就等上游产业驱动，未来两年吧