满分室间质评之GATK Somatic SNV+Indel+CNV+SV（下）性能优化

最新推荐文章于 2024-04-16 19:45:00 发布
最新推荐文章于 2024-04-16 19:45:00 发布
阅读量3k 收藏 12
点赞数 4
分类专栏： 生信分析流程 生信分析 图形化通用生信分析系统/平台开发
版权声明：本文为博主原创文章，遵循 CC 4.0 BY-SA 版权协议，转载请附上原文出处链接和本声明。
本文链接：https://blog.csdn.net/weixin_39900139/article/details/107788496
版权

我们接上文：满分室间质评之GATK Somatic SNV+Indel+CNV+SV一文中实现了对于卫计委室间质评数据分析以及与满分结果的匹配。本文将着重解决，保证最终结果一致的情况下，如何优化分析性能（并行化），如何将分析时间从 3h 59m 53s缩短至 1h 10m 38s。

  • 优化的方向：实际运行GATK4.X的工具如Mutect2时，发现其运行效率相当低，从CPU占用率，内存占用，硬盘I/O都占用很低，起初自己DIY时候，将要分析的bed/interval_list文件按照染色体编号拆分（不太确定分析结果的一致性，所以比较谨慎），然后并行分析，最后将结果合并。后来GATK从4.0.6.0升级到4.1.3.0时候发现官方的best practice pipeline也做了类似的处理，这里就有了优化的空间。
  • 还有一些工具Cnvkit,Manta,samtools depth 和 samtools flagstat 运行时对硬件资源利用也不充分（CPU占用，内存、硬盘IO等），可以考虑把这些任务并行运行以减少最终的运行时间。
  • 优化后结果的一致性，首先官方提供了一系列工具，从直接感觉上应该是没有问题的，从室间质评的结果来看，标准结果上的突变一致性没有问题。非标准结果上会有一些出入，不影响最终结果。当然，目前还做不到全自动，最终的结果还是要使用IGV人工检查一遍。

本文中分析流程（pipeline）的运行环境

名称描述数量
CPUAMD Ryzen3 3950X 16核心32线程 全核满载4.2G×1
内存64G16G ×4
硬盘海康威视 C2000Pro 2T×1
三星PM983 3.84T×1

本文用到的分析流程文件及结果

名称 （点击下载）备注
FFPE SNV CNV SV V2.4.workflow分析流程文件，可以一键导入SliverWorkspace分析系统(点击查看操作)
当然可以参照图片中运行脚本，shell里运行，效果也是一样
最终结果过滤脚本（python2.7 )及编译版本Illumina_pt2.bed 等用到的bed，intelval等文件
SnvAnnotationFilter.py SNV过滤脚本
CnvAnnotationFilter.py CNV过滤脚本
SvAnnotationFilter.py SV 过滤脚本
QcProcessor.py 获取整体QC数据的脚本
report_template.docx 分析报告模板
分析结果（pipeline结果与标准答案）result.zip pipeline结果与标准答

本文用到的环境变量

变量名称变量值类型
sn1701数值
data/opt/data （原始fastq文件存放目录）目录
result/opt/result（中间文件及最终结果文件存放目录）目录
tools.java/opt/jdk1.8.0_162/bin/java程序
tools.fastqc/opt/FastQC/fastqc程序
tools.bwa/opt/bwa/bwa程序
tools.samtools/opt/samtools/samtools程序
tools.sambamba/opt/ref/sambamba-0.7.0-linux-static程序
tools.bgzip/opt/tabix-0.2.6/bgzip程序
tools.tabix/opt/tabix-0.2.6/tabix程序
tools.gatk/opt/ref/gatk-4.1.3.0/gatk程序
tools.manta/opt/manta/dist/bin/configManta.py程序
tools.cnvkit/usr/local/bin/cnvkit.py程序
refs.gene/opt/ref/hg19_refGene.txt文件
refs.dict/opt/ref/ucsc.hg19.dict文件
refs.hum/opt/ref/ucsc.hg19.fa字符
refs.bed/opt/ref/projects/Illumina_pt2.bed文件
refs.interval/opt/ref/projects/Illumina_pt2.interval_list文件
refs.dbsnp/opt/ref/dbsnp_138.hg19.vcf文件
refs.mills/opt/ref/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf文件
refs.1000G/opt/ref/1000G_phase1.indels.hg19.vcf文件
refs.af_only/opt/ref/af-only-gnomad.raw.sites.hg19.vcf.gz文件
refs.small.exac/opt/ref/small_exac_common_3_b37.vcf文件
envis.threads32数值
cutoff.TLOD16.00数值
cutoff.event2数值
cutoff.cnvdep1000数值
cutoff.nvaf0.005数值
cutoff.cnv_min-0.5数值
cutoff.cnv_max0.5数值
cutoff.vaf0.01数值
envis.scatter8数值

惯例:优化后分析流程(pipeline)：

在这里插入图片描述

下面看看优化过程

  • INPUT 输入文件（无变化）

在这里插入图片描述

  • Normal：Map & Order & MarkDuplicate 合并完成
    在这里插入图片描述
#bwa map完成接管道操作sambamba转换为bam，然后管道操作sambamba排序
${tools.bwa} mem \
    -t ${envis.threads} -M \
    -R "@RG\\tID:${sn}NC\\tLB:${sn}NC\\tPL:Illumina\\tPU:Miseq\\tSM:${sn}NC" \
    ${refs.hum}  ${data}/${sn}NC_R1.fastq.gz ${data}/${sn}NC_R2.fastq.gz \
    | ${tools.sambamba} view -S -f bam -l 0 /dev/stdin \
    | ${tools.sambamba} sort -t ${envis.threads} -m 2G --tmpdir=${result} -o {result}/${sn}NC_sorted.bam /dev/stdin
#设置每个进程打开文件的最大数为10240,防止markdup时候sambamba报错退出
ulimit -n 10240
#使用sambamba对sorted.bam标记重复
${tools.sambamba}  markdup \
	--tmpdir ${result} \
	-t ${envis.threads} ${result}/${sn}NC_sorted.bam ${result}/${sn}NC_marked.bam 
#sambamba生成的索引文件名与GATK默认的索引文件名不一致，这里重命名一下以符合GATK习惯
mv ${result}/${sn}NC_marked.bam.bai ${result}/${sn}NC_marked.bai
#删除${sn}NC_sorted.bam删除中间文件，节省硬盘空间
rm -f ${result}/${sn}NC_sorted.bam
  • Tumor：Map & Order & MarkDuplicate 合并完成
    在这里插入图片描述

除了fastq文件不同，处理过程一模一样

  • Recalibrator：Normal&Tumor 并行完成
    在这里插入图片描述

  • Process Dup Bam (对于标记重复后的Bam文件的处理，合并了很多步骤)

在这里插入图片描述

```shell
#此处是原先Manta分析SV的步骤一，生成runWorkflow.py，因为这一不步速度很快，所以串行执行
rm -f ${result}/${sn}/runWorkflow.py
python ${tools.manta} \
        --normalBam ${result}/${sn}NC_marked.bam \
        --tumorBam  ${result}/${sn}_marked.bam \
        --referenceFasta ${refs.hum} \
        --exome \
        --callRegions /opt/ref/projects/Illumina_pt2.bed.zip \
        --runDir ${result}/${sn}
# 对bam文件碱基质量校正的第二步，Normal & Tumor并行处理
${tools.gatk} ApplyBQSR \
	--bqsr-recal-file ${result}/${sn}_recal.table \
    -L ${refs.interval} \
    -R ${refs.hum} \
    -I ${result}/${sn}_marked.bam \
    -O ${result}/${sn}_bqsr.bam &


${tools.gatk} ApplyBQSR \
    --bqsr-recal-file ${result}/${sn}NC_recal.table \
    -L ${refs.interval} \
    -R ${refs.hum} \
    -I ${result}/${sn}NC_marked.bam \
    -O ${result}/${sn}NC_bqsr.bam &

#原先QC步骤，获取insert size，Normal & Tumor并行
${tools.gatk} CollectInsertSizeMetrics \
  -I ${result}/${sn}_marked.bam \
  -O ${result}/${sn}_insertsize_metrics.txt \
  -H ${result}/${sn}_insertsize_histogram.pdf &


${tools.gatk} CollectInsertSizeMetrics \
  -I ${result}/${sn}NC_marked.bam \
  -O ${result}/${sn}NC_insertsize_metrics.txt \
  -H ${result}/${sn}NC_insertsize_histogram.pdf &

# 运行manta SV分析
python ${result}/${sn}/runWorkflow.py -m local -j ${envis.threads} &

# 运行cnvkit CNV分析
${tools.cnvkit} batch \
	${result}/${sn}_marked.bam \
    --normal ${result}/${sn}NC_marked.bam \
    --method hybrid \
    --targets ${refs.bed} \
    --annotate /opt/ref/refFlat.txt \
    --output-reference ${result}/${sn}_reference.cnn \
    --output-dir ${result}/ \
    --diagram \
    -p 0 &

#samtools统计测序深度
${tools.samtools} depth -b ${refs.bed} ${result}/${sn}_marked.bam   > ${result}/${sn}_marked.depth &
${tools.samtools} depth -b ${refs.bed} ${result}/${sn}NC_marked.bam > ${result}/${sn}NC_marked.depth &
#samtools统计比对信息
${tools.samtools} flagstat --threads ${envis.threads} ${result}/${sn}_marked.bam   > ${result}/${sn}_marked.flagstat &
${tools.samtools} flagstat --threads ${envis.threads} ${result}/${sn}NC_marked.bam > ${result}/${sn}NC_marked.flagstat &

#使用GATK Splitintervals工具将interval_list拆分成若干份。方便后面使用
#这里要讲讲从GATK4.1.3.0这个版本开始的骚操作了。我算法资源使用效率低是吧，我把interval文件拆分成几份，并行分析之后再把结果合并，来达到提高效率的目的。后面GetPileupSummaries和Mutect2都会用到。
#根据硬件性能决定拆分多少份，也就是并行多少个，我这里是8份
rm -f ${result}/${sn}/*.interval_list
${tools.gatk} SplitIntervals \
    -R ${refs.hum} \
    -L ${refs.interval} \
    -O ${result}/${sn} \
    --scatter-count ${envis.scatter}

wait
```
  • Qc Process 处理以上文件，获取QC信息

在这里插入图片描述

  • GetPileupSummaries

在这里插入图片描述

这里要讲讲GATK4.1.3.0这个版本开始的骚操作了。我算法资源使用效率低是吧，我把interval文件拆分成几份，并行分析之后再把结果合并，来达到提高效率的目的。

# 这里循环拆分的interval_list文件运行GetPileupSummaries
for i in `ls ${result}/${sn}/*.interval_list`;
do
    ${tools.gatk} GetPileupSummaries \
        -R ${refs.hum} \
        -I ${result}/${sn}_bqsr.bam \
        -O ${i%.*}-pileups.table \
        -V ${refs.small.exac} \
        -L $i \
        --interval-set-rule INTERSECTION &
    
    ${tools.gatk} GetPileupSummaries \
        -R ${refs.hum} \
        -I ${result}/${sn}NC_bqsr.bam \
        -O ${i%.*}-pileups.nctable \
        -V ${refs.small.exac} \
        -L $i \
        --interval-set-rule INTERSECTION &
    
done
wait

#将运行结果*.table文件作为参数合并成一行，运行GatherPileupSummaries将结果合并成一个
tables=
for i in `ls ${result}/${sn}/*.table`;
do
    tables="$tables -I $i"
done
${tools.gatk} GatherPileupSummaries \
    --sequence-dictionary ${refs.dict} \
    $tables \
    -O ${result}/${sn}_pileups.table

nctables=
for i in `ls ${result}/${sn}/*.nctable`;
do
    nctables="$nctables -I $i"
done
${tools.gatk} GatherPileupSummaries \
    --sequence-dictionary ${refs.dict} \
    $nctables \
    -O ${result}/${sn}NC_pileups.table
  • CalculateContamination 计算污染

在这里插入图片描述

  • Call SNV INDEL

在这里插入图片描述

#vcf-file.list记录了并行分析输出的结果，后面合并要用到
rm -f ${result}/${sn}/vcf-file.list
touch ${result}/${sn}/vcf-file.list

#循环使用拆分后的interval_list文件运行Mutect2
for i in `ls ${result}/${sn}/*.interval_list`;
do
   rm -f ${i%.*}_bqsr.vcf.gz
   ${tools.gatk} Mutect2 \
        -R ${refs.hum} \
        -I ${result}/${sn}_bqsr.bam -tumor  ${sn} \
        -I ${result}/${sn}NC_bqsr.bam   -normal ${sn}NC \
        -L $i \
        -O ${i%.*}_bqsr.vcf.gz \
        --germline-resource ${refs.af_only} \
        --native-pair-hmm-threads ${envis.threads} &
    echo ${i%.*}_bqsr.vcf.gz >> ${result}/${sn}/vcf-file.list
done
wait

#生成合并参数，运行MergeMutectStats将状态文件合并
rm -f ${result}/${sn}_bqsr.vcf.gz.stats
stats=
for z in `ls ${result}/${sn}/*_bqsr.vcf.gz.stats`;
do
    stats="$stats -stats $z"
done
${tools.gatk} MergeMutectStats $stats -O ${result}/${sn}_bqsr.vcf.gz.stats

#合并并行分析得到的vcf.gz
${tools.gatk} MergeVcfs \
    -I ${result}/${sn}/vcf-file.list \
    -O ${result}/${sn}_bqsr.vcf.gz
  • FilterMutectCalls 使用GATK提供的过滤器过滤SNV&Indel

在这里插入图片描述

  • 将过滤后的文件转换为Annovar注释所需要的格式

在这里插入图片描述

  • 使用Annovar注释

在这里插入图片描述

  • 使用自己写的脚本对注释后的结果过滤，比如按照室间质评要求，过滤掉突变频率低于1%，测序深度低于500的突变。对GATK某些过滤器过滤掉的结果进行保留和排除，后面使用IGV进行人工筛选。最终输出的结果为，${sn}.result.SNV.xls（其实是个csv文件，扩展名改为.xls是便于使用excel打开，很多人都这么干）

在这里插入图片描述

  • 使用CnvKIt，获取CNV突变（接Process Dup Bam）

在这里插入图片描述

  • 使用py脚本文件，对CnvKit输出结果过滤。同样根据hg19_refGene.txt文件匹配基因，以及发生拷贝数变异的区域的外显子区域等。

在这里插入图片描述

  • 使用CnvKit画图

在这里插入图片描述

  • 使用python脚本对Manta获取的SV过滤。如根据SOMATICSCORE分数过滤，根据hg19_refGene.txt提供文件，计算突变基因等等。（接Process Dup Bam）

在这里插入图片描述

  • 最终结果

在这里插入图片描述

  • 整个pipeline运行情况，可以看到消耗时间明显降低，约为原先1/3时间。

在这里插入图片描述

weixin_39900139
关注
  • 4
    点赞
  • 踩
  • 12
    收藏
    觉得还不错? 一键收藏
  • 0
    评论
专栏目录
gatk4中的interval是什么？？
qq_21478261的博客
07-05 698
以gatk Mutect2为例intervals到底是啥？是bed？是Picard是VCF files？本文详细搞定这个问题。Interval lists define subsets of genomic regions, sometimes even just individual positions in the genome. You can provide GATK tools with intervals or lists of intervals when you want to restri
满分室间质评之GATK Somatic SNV+Indels+CNV+SV（上）
SliverWorkspace
07-31 3348
卫计委在2017年，2019年，2020年（还没有答案）提供标准数据用于肿瘤生信分析的室间质评。这样预知结果的数据自然是不能放过了，本文尝试参考GATK Best Practice：Somatic SNVs + Indels ，Cnvkit，Manta的pipeline来完成满分流程分析，也可以使用标准数据反向判断GATK Mutect2的实际准确度,算法优劣。 注：本文仅用于学习，距离真正的临床应用还有相当大距离，欢迎大佬批评指正 **1. 分析流程概览如下： 2. 本文用到的分析系统及分析流程文件
gatk-sv
03-19
GATK-SV 用于Illumina短读全基因组测序（WGS）数据的结构变异发现管道。 目录 原始呼叫者和证据收集 批量质量控制 -gCNV模型创建 批量证据合并，BAF生成和深度调用者 网站集群 网站指标 过滤 跨批次站点合并 基因分型 基因型优化（可选） 跨批次集成，复杂事件解决和VCF清理 下游过滤 注释 质量控制和可视化 附加模块-Mosaic和de novo 部署和执行： 一个帐户。 支持（WDL）的流执行系统，可以： （v36或更高版本）。强烈建议使用专用服务器。 或 （请注意，此平台尚不支持预配置的GATK-SV工作流程） 推荐： 。由于许可限制，我们无法为此算法提供公共docker映像或参考面板VCF。 推荐：用于与专用Cromwell服务器进行交互的 。 推荐：用于验证WDL / json文件的 。 数据： Illumina短读全基因组CRAM或BAM，与带有hg38
SNV分析软件/工具
wangprince2017
11-14 2358
体细胞SNV Calling 的文献： A review of somatic single nucleotide variant calling algorithms for next-generation sequencing data 网址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2001037017300946#bb0120 ...
收集资料分享：《肿瘤TMB,SNP,CNV,INDEL,MSI》
最新发布
weixin_69558614的博客
04-16 1111
TMB是指肿瘤基因组内存在的体细胞突变位点数量，可以间接反映肿瘤产生新生抗原的能力。由于早期研究多基于WES检测，因此TMB通常是指单位基因组外显子编码区域（外显子组，exome）的突变数量（mutations, muts），单位为muts/exome。虽然WES是检测TMB的金标准，但WES时间成本和分析成本较高。经过多项大样本研究验证后，TMB检测从WES扩展到了更切合临床实际的靶向二代测序（next-generation sequencing panel, NGS panel）。
GATK Somatic 流程学习1
coolsen133的专栏
01-11 817
1. 主要是参考链接https://software.broadinstitute.org/gatk/documentation/article?id=9183#1 的步骤，阅读了解相应的介绍 2. https://console.cloud.google.com/storage/browser/gatk-best-practices/somatic-b37/?project=broad-dsd...
GenomicsDB：C ++中的高性能数据存储，用于导入，查询和转换带有CC ++ JavaSpark绑定的变体数据。 在gatk4中使用
02-05
GenomicsDB是用C ++编写的高性能可扩展数据存储，用于导入，查询和转换基因组变异数据。 支持的平台：Linux和MacOS。 支持的文件系统：POSIX，HDFS，EMRFS（S3），GCS和Azure Blob。 包括JVM / Spark包装器，除其他...
gatk_recalibrate_and_realign:GATK Indel校正和质量校正
05-07
此应用程序对Mappings对象应用了许多重新计算，以提高变量调用的质量。 该过程遵循Broad Institute关于变式调用最佳实践的建议。 映射在已知插入缺失的位点周围进行重复数据删除和重新排列，并通过查看质量指标与...
gatk:GATK版本4及更高版本的官方代码存储库
05-11
该存储库包含下一代的基因组分析工具包（GATK）。 该存储库的内容是100％开源的，并根据Apache 2.0许可发布（请参阅 ）。 GATK4旨在在简化的框架下将来自和代码库的完善工具集中在一起，并使选定的工具能够使用在...
atlas_gatk4:在Atlas HPC上测试gatk4模块
04-07
Atlas HPC上的GATK4模块 在Atlas HPC上测试gatk4模块 示例数据集 重用GATK nextflow管道中的数据集（ ） wget https://iastate.box.com/shared/static/wt85l6s4nw4kycm2bo0gpgjq752osatu.gz tar -xf wt85l6s4nw4...
FishingCNV:外显子组测序数据中的拷贝数变异（CNV）检测-开源
04-29
FishingCNV是由麦吉尔大学开发的软件工具，是用于全面分析高通量外显子组测序数据中稀有拷贝数变异的工具。 输入是由Genome Analysis ToolKit（GATK）生成的标准coverage文件，而输出是包含推定CNV的文件。 该程序有2个不同的发行版* GUI版本（FishingCNV_X.XXzip）*命令行版本（FishingCNV_X.X_pipeline）浏览我们的文件以查找不同的发行版。
sambamba, 使用 sam/bam数据的工具.zip
09-18
sambamba, 使用 sam/bam数据的工具 SambambaSambamba是一种高性能的现代健壮和快速工具( 和图书馆)，用编程语言编写，用于处理SAM和BAM文件。 当前功能是samtools功能的一个重要子集，包括视图。索引。排序。markdup和深度。 大多
mosdepth：用于WGS，外显子组或靶向测序的快速BAMCRAM深度计算
02-03
快速的BAM / CRAM深度计算的WGS ，外显子组或靶向测序。 mosdepth可以输出： 每个碱基的深度约为快速samtools depth 2 samtools depth -30倍基因组的CPU时间约为25分钟。 给定窗口大小的平均每个窗口深度-用于CNV调用。 给定区域的BED文件的平均每个区域。 给定窗口大小的平均或中位数每区域累积覆盖率直方图 每个染色体和全基因组的指定阈值以上的碱基所占比例的分布。 合并相邻碱基的量化输出，只要它们落入相同的覆盖区域即可，例如（10-20） 阈值输出，以指示在给定阈值下每个区域覆盖了多少个碱基。 每个染色体以及每个染色体指定区域内的平均深度的摘要。 文件（比bigwig更好）。 在适当的情况下，将输出文件进行bgzip压缩并建立索引以便于使用。 用法 mosdepth 0.3.0 Usage: mosdepth [options] <prefix> <BAM> Arguments: <prefix> outputs: `{prefix}.mosdepth.global.dist.t
使用gatk检测WES数据中的cnv
Q.1的博客
04-26 6225
gatk的cnv流程对环境依赖较高，需要调用许多python包，推荐在dockerhub里找官方镜像，或者用conda来配置环境。 1、dockerhub 在本地的docker环境中直接拉取镜像，如果没有root权限就用conda安装。 docker pull broadinstitute/gatk:4.1.6.0 2、conda 先下载一个miniconda或者anaconda，然后下载好ga...
GATK / 体细胞短变异检测工具Mutect2的使用
悟道西方
06-24 6560
前文回顾1. GATK官方教程 / 概述及工作前的布置2. GATK教程 / 体细胞短变异检测 (SNV+InDel)流程概览3. GATK教程 / 变异检测前的数据预处理(如何)使用GATK4 Mutect2调用体细胞突变(How to) Call somatic mutations using GATK4 Mutect2·本教程适用于Mutect2版本4.1.1....
GATK变异检测
weixin_45606903的博客
08-13 9061
变异检测 GATK 变异检测 简述：GATK(全称The Genome Analysis Toolkit) ,是基于二代测序的分析软件，主要功能是寻找变异位点。 数据类型：Illumina数据 软件版本：Gatk 4.1.8.1、fastp 0.20.0、bwa 0.7.17、samtools 1.9 测试数据： $ ref = /home/jingke.meng/database/hg19_BWA /hg19.fa $ fq1 = /home/jingke.meng/GATK_passway/Illu
一文理解全外显子家系和病例-对照参考基因组比对和变异检测全流程
weixin_42192188的博客
08-14 1409
这篇文章是我的生信社群的部分内容，现在开个遗传学专栏，分享一些遗传学数据分析教程，更多教程可以加入我的生信社群查看。看完这篇文章，完全理解参考基因组比对和变异检测全流程！
gatk GetPileupSummaries报错：Exception in thread “main“ java.lang.OutOfMemoryError: Java heap space
sunjunaaa的博客
02-05 375
增加参数：--java-options -Xmx500G 来增加该程序的内存占用，调试后发现100G都不够，加到500G！f问题描述是内存溢出的问题（OOM）该程序也太吃内存了吧。
10 拷贝数变异分析（非GATK）
qq_23435961的博客
01-08 1722
12 拷贝数变异分析（非GATK） CNVkit CNVkit 的用法比较简单，可以参考官网的教程：https://cnvkit.readthedocs.io/en/stable/index.html，写得很 详细，这里我不再说明。下面是我用到的脚本（在这里我比较关心的是最后拿到的 segment 文件，即 final.seg，该文件可以用直接载入到 IGV 进行可视化，当然也可以用 cnvkit.py export 生成这样的 segments 文件，两者基本一样，然后和上一节 GATK 的结果进行比较
spark gatk
01-24
Spark GATK是指在Spark集群上运行GATK（Genome Analysis Toolkit）工具。GATK是一个广泛使用的工具集，用于分析基因组数据。它提供了一系列的工具，用于变异检测、变异过滤、变异注释等。 在Spark集群上运行GATK...
评论
添加红包

请填写红包祝福语或标题

个

红包个数最小为10个

元

红包金额最低5元

当前余额3.43元 前往充值 >
需支付：10.00元
成就一亿技术人!
领取后你会自动成为博主和红包主的粉丝 规则
hope_wisdom
发出的红包
实付元
使用余额支付
点击重新获取
扫码支付
钱包余额 0

抵扣说明：

1.余额是钱包充值的虚拟货币，按照1:1的比例进行支付金额的抵扣。
2.余额无法直接购买下载，可以购买VIP、付费专栏及课程。

余额充值