目录
1.TMP
1.1 TMB的定义
TMB是指肿瘤基因组内存在的体细胞突变位点数量，可以间接反映肿瘤产生新生抗原的能力。由于早期研究多基于WES检测，因此TMB通常是指单位基因组外显子编码区域（外显子组，exome）的突变数量（mutations, muts），单位为muts/exome。虽然WES是检测TMB的金标准，但WES时间成本和分析成本较高。经过多项大样本研究验证后，TMB检测从WES扩展到了更切合临床实际的靶向二代测序（next-generation sequencing panel, NGS panel）。靶向测序的基因检测位点比外显子组少，由于不同平台检测方法和测序覆盖的外显子区域长度不同，TMB也被定义为肿瘤基因组区域中每兆碱基（megabase, Mb）发生的碱基替换突变和插入缺失突变的数量总和，单位为muts/Mb。不同研究纳入TMB计算的突变类型不同。例如，CheckMate-026研究中，TMB被定义为通过WES测序肿瘤组织样本中体细胞非同义突变数量的总和。在NGS panel检测TMB的研究中，纳入TMB计算的是体细胞编码区中碱基替换突变和插入缺失突变，部分NGS panel计算TMB也同时纳入了同义突变，而胚系变异、核苷酸多态性位点、明确的抑癌基因及驱动基因热点突变则不计算在内。
1.2 TMB的检测方法
1.2.1 WES
WES是测定肿瘤TMB的金标准。NSCLC、黑色素瘤和尿路上皮癌等癌种的早期免疫治疗研究均使用WES计算TMB。由于同义突变产生新生抗原的可能性较低，利用WES计算TMB时仅纳入非同义突变。但WES检测成本较高、对样本要求较高、数据分析较为复杂，在临床应用中有较大的局限性。到目前为止，FDA仅批准了一款采用WES技术检测TMB的产品（Omics CoreSM, NantHealth）。
1.2.2 NGS panel
通过NGS panel检测TMB的计算标准为每百万碱基中单碱基突变（可以纳入同义突变）以及短插入和缺失突变。NGS panel检测TMB需要与WES检测TMB有较高的一致性。有研究指出，对于突变频率高的肿瘤，较小的NGS panel足够用于TMB评估。但也有一些证据发现检测的基因数越多，TMB的检测结果与WES的一致性越高，NGS大panel可能更适合评估TMB。对于TMB较高的样本，不同大小的NGS panel检测结果差异可能不显著；而对于TMB较低的样本，检测结果的不一致性显著增加。目前一般认为NGS panel ≥0.8 Mb可以较好地评估肿瘤组织TMB水平。测序深度是每个碱基读长的平均次数。WES的测序深度约100×，对于等位基因突变频率大于15%的位点检测较灵敏。NGS panel的测序深度应大于500×，可提高低频突变的检测敏感性。目前已有两款基于组织的panel产品（FoundationOne CDx，Foundation Medicine和PGDx Elio Tissue Complete，Personal Genome Diagnostics）和一款基于血液的panel产品（FoundationOne Liquid CDx, Foundation Medicine）获得FDA批准用于TMB检测。计算机模拟及临床实践均证明经这些NGS panel检测的TMB与经WES检测的TMB有较好的一致性，并且在临床试验中证实可以预测免疫治疗疗效。此外，测序操作建议选用国家药品监督管理局（National Medical Products Administration, NMPA）或者FDA批准的测序仪器。通过NGS panel检测TMB需经过模型建立、虚拟验证、技术验证和临床验证。
1.3 影响TMB检测的因素
样本收集阶段、DNA处理阶段、测序阶段、生物信息分析阶段和报告生成阶段均会影响TMB检测的可靠性。样本收集阶段主要包括样本类型、肿瘤类型、肿瘤异质性和克隆进化等影响因素；DNA处理阶段包括DNA质量和数量、文库构建等影响因素；测序阶段包括DNA捕获区域、测序深度、覆盖读长、测序平台等影响因素；生物信息分析阶段包括突变类型、胚系突变过滤、等位基因突变频率等影响因素；报告生成阶段包括瘤种分类、患者人群、患者数量、TMB排序标准等影响因素。除了考虑技术因素，流程监管、样本收集和处理质控以及样本运送时长等因素可能也会影响样本质量，从而影响检测结果。
1.4 TMB的临床意义
免疫检查点分子可负向调控细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，从而抑制新生抗原驱动的抗肿瘤免疫反应。PD-1抗体、PD-L1抗体和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA-4）抗体能够与免疫检查点分子结合，恢复细胞毒性T细胞对肿瘤细胞杀伤活性，启动抗肿瘤免疫反应。高TMB的肿瘤往往携带较高水平的新生抗原，肿瘤特异性体细胞突变所产生的新生蛋白或其降解产物被主要组织相容性复合体递呈到肿瘤细胞表面，形成肿瘤新生抗原，可能导致T细胞的激活，故能提高ICIs的治疗敏感性。现有证据表明，TMB是晚期肺癌免疫治疗的疗效预测因子和预后的影响因素。从2015年至今，已经有大量临床研究探索了TMB对肺癌免疫治疗疗效的预测作用。KEYNOTE-158是其中一项里程碑式研究，该研究纳入10个癌种共计1,032例难治性实体瘤患者，结果表明Pembrolizumab在高TMB患者中总体客观缓解率（objective response rate, ORR）为29%，而低TMB患者ORR仅为6%。基于该结果，Pembrolizumab被FDA批准用于高TMB且既往治疗后疾病进展的不可手术或转移性实体瘤患者，其中高TMB定义为组织TMB≥10 muts/Mb。除了基于肿瘤组织检测TMB，通过液体活检技术评估血液TMB（blood-based TMB, bTMB）水平并预测免疫治疗疗效也展开了初步探索。2018年发表于Nature Medicine的一项回顾性研究分析了bTMB与Atezolizumab疗效的相关性，该研究发现高bTMB的晚期NSCLC患者接受Atezolizumab治疗后ORR和PFS得到显著改善。2019年发表于JAMA Oncology的另一项研究[24]证实了通过NGS panel计算的bTMB同样能够预测晚期NSCLC患者接受免疫治疗的ORR和PFS。2020年发表在Journal of Thoracic Oncology的一项研究进一步优化了bTMB算法，证实LAF-bTMB（low allele frequency, bTMB）能够有效地预测晚期NSCLC患者接受免疫治疗的ORR、PFS以及OS。这些研究表明，bTMB在预测免疫治疗疗效中具有一定前景。
2 SNP
2.1什么是SNP
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即在群体中，基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸，并且其出现的频率大于1%。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition嘧啶和嘧啶之间或者嘌呤和嘌呤之间的交换）或颠换（transversion嘧啶和嘌呤之间的交换）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。SNP 在CG 序列上出现较为频繁，由于CG 中C 即胞嘧啶常被甲基化，自发脱氨后即变为胸腺嘧啶T，因此大多数情况下，都是发生的C→T的转换，而变成A和G的概率很小，所以一般认为SNP是二等位的，或者是二态性，即一个碱基只会突变为另一种碱基，而不会同时突变为另外多种碱基。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs只需要＋／－的分析，而不用分析片段的长度，也让其应用更为广泛。
2.2 SNP与点突变有什么区别？
SNP是单碱基多态性，是一个群体概念，这个差异占群体的1%以上。若germline mutation频率<1%，则认为是一个点突变。SNP是各种生物都有的，通过同源基因比对获得的，一般不会发生变化，而点突变只对单一基因而言，所以从数量上SNP比点突变多得多。如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突变群没有达到总群体的1%，它就只有一个突变株/系，达到了1%就是多态性了。
2.3 SNV和SNP的区别？
SNV，即单核苷酸位点变异（single nucleotide variants），SNP，即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)，这两个概念都是指单核苷酸的改变，只不过SNP一般是二态的，而SNV没有这样的限制。另外，如果只是在病人体内检测到单个核苷酸的变异，而其在人群中出现的频率未知，则可看作SNV。
2.4 SNP检测方法
1、测序法，2、TaqMan探针法，3、ARMS-PCR法，4、分子信标法，5、高分辨率熔解曲法，6、CAPS法，7、SNaPshot法，8、KASP法，9、基因芯片法，10、质谱法。
3. CNV
拷贝数变异(Copy number variation, CNV)是由基因组发生重排而导致的1 kb 以上的基因组片段的缺失或重复。常染色体和女性X染色体正常拷贝数值为2，男性X和Y染色体正常拷贝数值为1，当拷贝数检测数值大于正常值时即为重复，小于正常值时为缺失。
用来进行全基因组范围的 CNV 研究的方法有: 基于芯片的比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization, aCGH)、SNP 分型芯片技术和新一代测序技术。CNV的形成机制有多种, 并可分为DNA重组和DNA错误复制两大类。CNV可以导致呈孟德尔遗传的单基因病与罕见疾病, 同时与复杂疾病也相关。其致病的可能机制有基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等。
最常见的CNV位于22q11.2, 这个区域发生的缺失称之为:22q11.2微缺失综合征。染色体数目异常引起的疾病最常见的有21-三体综合征，也就是常讲的唐氏综合征，还有18-三体综合征，13-三体综合征，特纳综合征等也都是拷贝数变异导致的。
4. 什么是InDel
插入和缺失（Insertion and Deletion，InDel），是指在基因组序列中发生的小片段的插入或缺失，其长度在1-50bp 之间。
与SNV不同的是，InDel涉及的变化并不单单是单个碱基上的，是DNA序列上某一位点相比参考序列插入或缺失了一个或多个碱基。Small InDel在基因组中的变异一般比SNV变异少，它可以发生在基因组的任何位置，包括基因内、外显子、内含子、编码区、非编码区和调控区域等。
当indel发生在编码区或剪接位点处，可能会导致蛋白质结构和功能的改变，从而影响生物体的性状。如编码区的 InDel 会引起移码突变，即插入或缺失的碱基串的长度为3的非整数倍，可能导致整个阅读框的改变，与非移码突变比较，移码突变对基因功能的影响更大。
从二代测序数据得到的InDel结果，可以通过以下方法进行下一步验证：
1）Sanger测序。通过PCR扩增，对PCR产物样品进行测序，然后比对参考序列或进行序列比对来检测InDel；
2）PCR检测+电泳。使用特定的引物扩增目标序列，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物中是否存在InDel；
3）基因芯片。使用基因芯片检测目标序列中是否存在indel，可以通过探针杂交和信号检测来实现;
4）ddPCR。通过对基因组中的目标序列进行扩增和荧光信号分析，可以精确地检测出InDel.
5.MSI
5.1 MSI概念
微卫星是存在于原核生物和真核生物的基因组中，通常由1～6个碱基对组成的DNA串联重复序列，其又被称作简单重复序列或短串联重复序列，常见类型包括单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复或四核苷酸重复等。微卫星的多态性主要由核心区重复序列的拷贝数差异引起，在一类重复序列中1个特定序列重复的丰度可能有较大差异，如在单核苷酸重复的情况下，poly（A）或 poly（T）的密度比poly（G）或 poly（C）的密度大 300 倍。 在二核苷酸重复序列中，AC和AT较多，CG最少。 由于DNA错配修复（mismatch repair， MMR）基因的突变或表观遗传发生变化，DNA MMR系统的正常功能被破坏、微卫星碱基对数量发生改变称为MSI。 微卫星作为重要的序列组成部分，在基因组调控中发挥多种作用。 微卫星DNA多样性，是构成人类基因组多样性的分子机制之一。
5.2MSI 的致病机制（MMR 机制）
5.2.1 MMR 组成与功能
1964 年，MMR 系统阐述了细菌和酵母中的 DNA 切除 － 再合成过程，主要纠正在 DNA 中产生的错配核苷酸或插入 － 缺失环的复制错误。 MMR 基因的产物是 MMR 蛋白，属于核酸水解酶。DNA 在复制过程中会不可避免地发生错误，而 MMR 系统起到负责监视和修正 DNA复制和重组过程中的错误，使 DNA 能精确复制，保证遗传的保守性和稳定性。
MMR 系统广泛存在于生物体内，在大肠埃希菌（ esche⁃richia coli，E． coli） 中发现 MMR，即 MutSLH 依赖于 MutS、MutL、MutH 等基因编码的产物。 在 E. coli 的 DNA 复制过程中，新生链上约256 个碱基对出现1 次 GATC 序列，在被合成后的短时间内不会被甲基化，而此时模板链上的 GATC 序列已被甲基化。该差异使模板链与新生链暂时得以区分，为MutSLH⁃MMR 特异性识别提供前提和基础。MutS 识别错配或未配对碱基并与之结合，MutL 参与形成复合体“ MutL⁃MutS⁃DNA”，并激活 MutH 的核酸内切酶活性，在错配位点附近（GATC）序列处将非甲基化的 DNA 链切割，然后核酸外切酶在解螺旋酶和单链 DNA 结合蛋白的协助下，将非甲基化的 DNA 序列从 GATG 位点至错配位点整段去除。
目前，真菌和哺乳动物体内的 MMR 系统也开始得到进一步探索。 研究发现多个 MMR 相关分子，主要包括 5 个MutS 同源体（MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6）、4 个 MutL同源体（MLH1、MLH2／PMS1、MLH3、MLH4／PMS2）、MutH 同源体和 UvrD 同源体。人类 MMR 系统中的主要蛋白包括MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、PMS2 和 MLH3，它们以异源二聚体的形式相互作用。MSH2 与 MSH6 或 MSH3 偶联（分别形成 MutSα 和 MutSβ 复合物），2 个异源二聚体均可识别新合成的 DNA 核苷酸链上的碱基错配，并与错配位点结合；MLH1 与 PMS2、PMS1 或 MLH3 偶联（分别形成 MutLα、MutLβ 或 MutLγ 复合物），与结合到 DNA 链上的 MutSα 或MutSβ 形成暂时性的复合物启动 MMR，与有关的酶相互配合，切除含有错配碱基的 1 段 DNA 链，以代替被切除的 DNA链，完成含错配碱基 DNA 核酸链的修复（图 2）。
5.3 MMR 与 MSI 的关系
微卫星序列是 DNA 复制过程中最易发生错配的序列，需要 MMR 相关蛋白修复。 MMR 是高度保守的细胞过程，在 DNA 复制过程中起重要作用。 有研究证实，MMR 使 DNA 复制的准确性提高 100 ～ 1 000 倍。若 MMR 功能缺陷，微卫星出现的复制错误得不到纠正并不断累积，使微卫星序列长度或碱基组成发生改变称为 MSI。
同时，导致基因组呈高突变表型，即 MSI 是 MMR 缺陷导致的结果，故可通过检测 MMR 蛋白缺失反映 MSI 状态。 采用免疫组化法检测肿瘤样本中 MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 表达，若 4 个 MMR 蛋白均阳性，则为错配修复功能完整（mis⁃match repair proficient， pMMR）；任一 MMR 蛋白缺失即为dMMR。 通常 dMMR 相当于 MSI⁃H 表型，pMMR 相当于 MSI⁃L／ MSS 表型，根据免疫组化检测结果可提示是否进行特定MMR 基因的突变检测。
5.4 MSI 的临床意义
MSI 最早在结直肠癌中发现，其在结直肠癌、胃癌和子宫内膜癌等多种实体瘤中高发，在林奇综合征筛查、化疗药物选择、预后预测和免疫检查点抑制剂获益人群筛选等方面具有重要意义。 2021 年，美国 NCCN 指南推荐结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌和小肠腺癌的新确诊患者常规检测MSI，同时也推荐前列腺癌、胰腺癌等进行 MSI 检测以指导免疫治疗。 CSCO 结直肠癌诊疗指南推荐结直肠癌患者行MSI／ MMR 检测，《结直肠癌分子检测高通量测序中国专家共识》（2021） 也将 MSI／ MMR 列为“ 必须检测的生物学标志物”。 《子宫内膜癌分子检测中国专家共识》 （2021）推荐对子宫内膜癌 MMR／ MSI 患者行林奇综合征筛查。 MSI检测对结直肠癌和子宫内膜癌等多种实体瘤患者的治疗，均有重要的临床意义
5.4.1 MSI 检测与林奇综合征的关系
林奇综合征是由MMR 基因（包括 MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 基因）胚系致病性突变，或 EPCAM 基因失活导致 MSH2 启动子高度甲基化，引起 MSH2 基因沉默所致的常染色体显性遗传性肿瘤综合征。 林奇综合征发病时间早，约占结直肠癌发生率的 3％ ，包括结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌和胃癌等多种肿瘤。由于 MMR 基因的功能失活，微卫星出现的复制错误得不到纠正并不断累积，90％ 的林奇综合征患者表现为 dMMR 和（或）MSI⁃H 表型。 结直肠癌患者无论年龄和分期，行林奇综合征筛查均有助于发现疾病。 《遗传性结直肠癌临床诊治和家系管理中国专家共识》 推荐对 MSI⁃H／ dMMR 的结直肠癌患者行 MMR 胚系检测，以明确诊断林奇综合征。
5.4.2 MSI 检测与 5⁃FU 类化疗药物的选择
MSI 检测能够预测结直肠癌辅助化疗的疗效，2003 年一项回顾性研究表明，MSI⁃H 结直肠癌Ⅱ／ Ⅲ期患者未从 5⁃FU 的单药辅助治疗中获益。 2010 年，Sargent 等［30］研究证实Ⅱ期 MSI⁃H 的结肠癌患者术后预后较好，患者未从 5⁃FU 单药化疗中获益，总生存期（overall survival， OS）缩短（HR ＝ 2. 95）。 国内外权威指南均指出，Ⅱ期 MSI⁃H／ dMMR 的结直肠癌患者预后较好，不建议使用氟尿嘧啶类药物治疗。 因此，Ⅱ期患者术后应常规行 MSI 检测以制定个体化治疗方案，MSI⁃H 的结直肠癌患者应尽可能避免氟尿嘧啶的单药辅助治疗。
5.4.3 MSI 检测与预后分层关系
MSI 检测对预测结直肠癌患者预后具有重要价值，MSI⁃H 的结直肠癌患者有显著的病理特征，包括近端结肠优势、分化程度差、丰富的黏液成分和淋巴细胞浸润增加。 MSI⁃H 在结直肠癌患者发生率为15％ ，现有数据表明，MSI⁃H／ dMMR 是Ⅱ期结直肠癌患者的独立预后指标，与 MSI⁃L／ pMMR 患者相比，其 OS 长和复发风险低。 此外，MSI 还可作为胃癌和小肠腺癌的预后因子。 一项荟萃分析表明，MSI⁃H 胃癌患者预后较好（HR ＝0. 63），但 MSI⁃H 胃癌患者未从 5⁃FU 单药辅助化疗获益。 在小肠腺癌中，与 MSS 患者相比，MSI⁃H 患者预后更佳。
5.4.3 MSI 检测与免疫检查点抑制剂获益人群的关系
2017年，美国 FDA 批准 PD⁃1 抗体帕博利珠单抗，用于不能手术或转移的 MSI⁃H／ dMMR 实体瘤患者的治疗，已成为首个不限癌种、 仅 以 生 物 学 标 志 物 进 行 治 疗 选 择 的 抗 肿 瘤 药物。 随后，CheckMate 142 研究表明，纳武利尤单抗治疗 MSI⁃H／ dMMR 转移性结直肠癌患者的有效率为 31％ ，中位无进展生存期（progression⁃free survival， PFS）为 14. 3 个月。 美国 FDA 批准纳武利尤单抗治疗 MSI⁃H 晚期结直肠癌患者。 KEYNOTE⁃177 研究表明，MSI⁃H／ dMMR 患者姑息一线应用帕博利珠单抗、标准化疗靶向治疗的客观有效率（ ob⁃jective response rate， ORR） 分别为 43. 8％ 和 33. 1％ ，中位PFS 分别为 16. 5 和 8. 2 个月，差异有统计学意义，晚期结直肠癌一线用药———帕博利珠单抗也再次获批，MSI 跻身为一线治疗标志物。 2021 年，我国首款自主研发的 PD⁃L1 抗体恩沃利单抗经国家药品监督管理局（National Medical Prod⁃ucts Administration， NMPA）获批上市，用于 MSI⁃H／ dMMR 成人晚期实体瘤患者治疗，结直肠癌、胃癌和其他实体瘤患者的 ORR 为 42. 7％ ，疾病控制率为 66. 0％ ，抗肿瘤疗效佳，为患者增加新的治疗选择。 总之，MSI⁃H／ dMMR 晚期结直肠癌患者可从 PD⁃1 ／ PD⁃L1 治疗中获益，通过检测 MSI 状态可以预估免疫检查点抑制剂的使用价值。
5．5 MSI 的检测方法
5.5.1 PCR ＋ 毛细管电泳技术
采用多重荧光聚合酶链式反应扩增（ quantitive fluorescent polymerase chain reaction， QF⁃PCR）结合毛细管电泳法，对微卫星位点和对照位点进行检测。 当微卫星位点用于判定样本 MSI 状态，对照位点除作为内部质控外，还可用于验证肿瘤组织和正常组织是否来自同一个体。 扩增体系中对每个检测位点设置 2 条引物，其中 1条标记特定荧光基团。 引物与对应的基因组 DNA 模板结合进行扩增，产生特定长度和荧光标记的扩增产物，扩增产物用毛细管电泳检测，通过特定长度的产物可以判定特定位点重复单元的重复状态。目前，PCR ＋ 毛细管电泳技术是 MSI 检测的公认“金标准”。 首先检测时分别提取肿瘤样本和对照样本的 DNA，其次使用试剂盒对正常组织和肿瘤组织的 DNA 进行 PCR 扩增，采用基因分析仪进行 DNA 片段分析，比较肿瘤组织和对照组织中各微卫星位点的电泳图峰型和数目，判断肿瘤组织相应位点的不稳定状态。为避免 PCR 实验室污染，建议选用含有尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG）防污染 MSI 检测体系，在 PCR 扩增前消化可能存在含有尿嘧啶的扩增产物，保证实验结果的准确性。
5.5.2PCR ＋ 高分辨率熔解曲线法
除多重荧光 PCR 结合毛细管电泳法外，也可使用 PCR 结合高分辨熔解曲线法检测相关 MSI 标志物。 高分辨率熔解曲线法通过在反应体中加入饱和 DNA 双链荧光染料，PCR 结束后进行 DNA 双链产物温解链反应获取荧光信号。 随着温度升高，DNA 双链氢键不断被打开，荧光染料释放，荧光强度逐渐降低。 不同核酸片段有特异性温度，即荧光强度变化曲线（又称熔解曲线）。 总的 DNA 双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列 DNA 的 Tm 值不同。 DNA 中 G⁃C 含量与Tm 值成正比，G⁃C 含量越高，Tm 值越高。 高分辨率熔解曲线法通过比较不同样本之间熔解曲线的位置和形状上的差异，区分基因的分型。熔解曲线技术被认为是最适合分辨单碱基的差异，因为饱和染料的使用，显著提高了高分辨率熔解曲线法在单碱基突变、小片段插入／ 缺失方面检测的灵敏度和分辨率。 PCR结合高分辨率熔解曲线法检测相关 MSI 单态性生物学标志物，该标志物一般为 8 ～ 12 个 A 或 T 碱基的单碱基重复序列（均聚物），分布在多个基因中。 在正常细胞（即 MMR 功能正常的细胞）中碱基数目保持稳定（如 11 个）。 在 MMR 功能缺陷的细胞（如癌细胞）中，这些均聚物更易变，并且通常观察到 1 或 2 个碱基对的删除，将长度为 11 的均聚物与长度为 10 的均聚物用于鉴别 MMR 的缺陷。
5.5.3 NGS 检测
MSI 状态可应用 WGS、全外显子组测序（whole exon sequencing，WES） 或靶向测序（ targeted gene se⁃quencing，TGS）等 NGS 技术进行检测。 美国 NCCN 结直肠癌临床实践指南（2022） 推荐可使用经验证的 NGS Panel进行 MSI 检测，尤其适用于需 RAS 和 BRAF 基因分型的转移性结直肠癌患者；美国 NCCN 小肠腺癌临床实践指南（2023）中 MSI 检测仅推荐经验证的 NGS Panel。 《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》（2019）、《结直肠癌靶向治疗中国专家共识》 （2022）和《中国结直肠癌肝转移诊断和综合治疗指南》 （2023），亦推荐可通过经验证的 NGS 法进行 MSI 检测。 NGS 检测 MSI 的优势：可覆盖大量的微卫星位点，根据 Panel 设计不同，可检测五至数十万个的微卫星位点，可针对特异性肿瘤或泛肿瘤选择不同的位点组合，对 MSI 状态的评估更加全面。目前，NGS 开发的 Panel 主要根据两种检测原理，通过不同的算法来检测 MSI。 （1）通过比较肿瘤样本与正常对照样本（或正常人的基线水平）之间的微卫星重复序列长度分布，以不稳定位点比例是否超过既定阈值来判断微卫星状态。如 MSI⁃sensor 使用成对的肿瘤和正常 WES 数据，比较单核苷酸到五核苷酸重复微卫星的等位基因长度分布，并对每个分析的基因座应用 χ2 分析，给出对应于不稳定微卫星基因座百分比的 MSI 得分，阈值为3. 5％。 MSI⁃ColonCore 中微卫星状态由样本中不稳定基因座与正常基线水平的百分比来确定，阈值为 40％。 （2）基于序列中的突变负荷和（或）微卫星中的突变负荷判断 MSI 状态，如 MSI⁃seq Index 是基于RNA 测序数据和两个测量值（PI⁃微卫星中的插入占 RNA 转录本中所有插入的比例；PD⁃微卫星中的缺失占 RNA 转录本中所有缺失的比例）的比率检测 MSI 状态，MSI⁃H 的 PI／ PD比值 ＜ 0. 9。 Nowak 等使用 275 个与癌症相关的基因定向测序数据，把总突变负担（ ＞ 40 Mb）和单核苷酸微卫星中的INDELs（ ＞ 5 Mb）定义为 MSI⁃H。 NGS 平台的 MSI 算法包括但不限于 MSI⁃sensor、MSI⁃ColonCore、MSI⁃seq Index 和 Nowak等，随着 NGS 的不断发展，将陆续开发出更多新算法，不断提高 NGS 检测 MSI 的准确度和敏感度。临床和病理医师对无法获取肿瘤组织的患者，可使用外周血循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）进行 MSINGS 检测。 由于液体活检诊断的准确性和灵敏度有限，目前不推荐常规行 ctDNA 的 MSI NGS 检测，仅作为无法获取肿瘤患者评价 MSI 状态的替代检测。
资料来源：
网址：生信路漫漫 | 变异检测篇—InDel突变，拷贝数变异（CNV）的解读（一），常见单核苷酸多态性（SNP）检测方法|生信发文利器，单核苷酸多态性（SNP）检测方法汇总
文章：《肿瘤突变负荷应用于肺癌免疫治疗的专家共识》，《微卫星不稳定性（ＭＳＩ）检测技术专家共识》。
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