trans-cinnamate 4-monooxygenase肉桂酸4-羟化酶C4H的克隆和功能鉴定-文献精读62

Cloning and functional characterization of two cinnamate 4-hydroxylase genes from Pyrus bretschneideri

两种从白梨（Pyrus bretschneideri）中克隆和功能鉴定的肉桂酸4-羟化酶基因

摘要

肉桂酸4-羟化酶（C4H）是植物苯丙素类代谢途径中的关键酶，参与木质素和黄酮类等次级代谢产物的生物合成。然而，C4H在梨（Pyrus bretschneideri）中的功能尚未完全阐明。通过搜索梨基因组数据库，我们鉴定了三个C4H基因（PbC4H1、PbC4H2和PbC4H3），编码的蛋白质与多个物种的典型C4H（具有典型的细胞色素P450结构域）具有较高的同源性，这表明这三个PbC4H基因也是典型的C4H基因，并与其他陆生植物的C4H基因有着密切的进化关系。定量实时PCR（qRT-PCR）结果表明，三个PbC4H基因在一个或多个组织中具有特异性表达。PbC4H1和PbC4H3的表达水平在梨果实发育过程中先升高后下降。外源激素处理（ABA、MeJA和SA）对三个PbC4H基因的表达产生了不同程度的影响。在ABA处理下，PbC4H基因的表达水平先上升后下降，而MeJA处理显著增加了PbC4H基因的表达水平。SA处理后，PbC4H1和PbC4H2的表达水平升高，而PbC4H3的表达水平下降。在酵母中表达的重组蛋白的酶促分析表明，PbC4H1和PbC4H3催化反式肉桂酸向对香豆酸的转化。此外，在拟南芥中表达PbC4H1和PbC4H3导致木质素含量增加，以及导管间纤维和木质部细胞壁厚度的增加。综上所述，我们的研究结果不仅揭示了PbC4H1和PbC4H3在木质素生物合成中的潜在作用，还为未来通过分子生物学技术研究梨果实中木质素合成及石细胞发育的调控奠定了基础。

1. 引言

苯丙素类代谢途径生成植物中重要的次级代谢产物，包括木质素、黄酮类和其他酚类次级代谢产物（Deluc等，2006）。苯丙素类化合物被认为是一类重要的植物次级代谢产物，在维持细胞壁结构、抵抗紫外线辐射以及应对生物和非生物胁迫中起着重要作用（Dixon等，1996；Wagner等，2009）。因此，对苯丙素代谢途径中的结构基因和调控基因进行系统研究有助于阐明植物次级代谢产物的生物合成和调控机制。 肉桂酸4-羟化酶（C4H）是苯丙素类代谢途径中的第二个关键酶，属于细胞色素P450家族（CYP73A）。以往研究表明，C4H通过N端的疏水螺旋区域锚定在内质网膜的细胞质表面，并与苯丙氨酸解氨酶（PAL）和4-香豆酸CoA连接酶（4CL）形成多酶复合物（Winkel，1999；Carocha等，2015）。然而，这种蛋白复合物的形成机制尚未完全理解。C4H编码基因已经在多种植物中被鉴定并克隆，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）（Mizutani等，1997）、油菜（Brassica napus）（Chen等，2007）和杨树（Populus trichocarpa）（Ro等，2001）。此外，重组C4H在体外催化肉桂酸向对香豆酸转化的功能已被广泛证实（Hotze等，1995；Cheng等，2018；Huang等，2019）。对香豆酸随后通过4CL催化生成对香豆酰CoA，此时苯丙素类代谢途径分支成多条路径，最终导致木质素、黄酮类和其他代谢产物的生物合成（Ehlting等，2006）。 苯丙素合成途径中关键酶的编码基因会在受伤、紫外线辐射和病原体感染时被协同激活（Gao等，2015）。例如，紫外线照射诱导了编码苯丙素代谢途径中关键酶（包括PAL和C4H）的基因表达，并在番茄果实储存期间增强了PAL和C4H的活性，这与酚类化合物水平的相应增加一致（Liu等，2018）。在辣椒中，C4H在干旱胁迫下被高度激活（Phimchan等，2014），而盐胁迫和冷胁迫则诱导了红麻（Hibiscus cannabinus L.）中C4H的表达（Kim等，2013）。最近的研究表明，甲基茉莉酸酯（MeJA）和甲基水杨酸（SA）通过抑制木质素合成途径中的关键基因表达，显著抑制了猕猴桃的木质化（Li等，2017）。此外，脱落酸（ABA）处理强烈诱导了4CL的表达，而ABA处理后miR 1886表达水平的降低与4CL转录水平和香茶菜（Coleus forskohlii）中木质素含量的增加有关（Praveen等，2017）。这些研究表明，这些外源激素在一定程度上可以减少或增加植物中的木质素积累。 ‘砀山酥’梨（Pyrus bretschneideri cv. Dangshan Su）是中国的一种商业果树品种（安徽省砀山县）（Cai等，2010），以其肉质果实在促进人类健康和营养方面的重要作用而闻名（Cao等，2018；Wu等，2013）。梨中的石细胞是通过果实发育过程中薄壁细胞次生细胞壁增厚而形成的一种木质化厚壁细胞（Jin等，2013），石细胞簇的含量和大小对梨果实的品质有显著影响（Cai等，2010；Cheng等，2017）。木质素是梨石细胞的主要成分之一（Brahem等，2017），木质素合成途径中的关键酶活性受相应基因表达的调控（Huang等，2019）。最近的研究表明，C4H缺陷植物中的总木质素和木质素单体含量显著减少，木质素的组成也发生了变化（Kumar等，2016）。因此，梨果实中的木质素合成可能直接受到C4H活性的影响。C4H基因的转录水平与C4H活性呈正相关，植物组织中C4H基因的高转录水平伴随着较高的木质素含量（Cheng等，2018）。C4H基因的特征和表达模式已在多种植物中被研究（Cheng等，2018；Xia等，2017）。然而，梨果实中C4H基因的详细特征尚未被充分描述，它们在木质素合成中的作用也尚未确定。 在本研究中，我们鉴定了梨基因组中的三个C4H编码基因。作为P450蛋白，这些酶含有典型的细胞色素P450结构域。生物信息学和基因表达分析的综合结果表明，PbC4H1和PbC4H3是参与梨果实木质化的关键基因。因此，我们对PbC4H1和PbC4H3进行了深入的表征。通过酵母中的异源表达研究了它们的酶促活性，并在拟南芥中过表达PbC4H以研究其对木质素含量的影响。这是首次对P. bretschneideri中的PbC4H基因进行克隆和功能鉴定的研究，研究结果可能为调控梨果实品质提供潜在方法。

2. 材料与方法

2.1. 植物材料、处理和生长条件

年生茎、芽、叶、花以及果实样本[开花后15、39、47、55、63、79、102和145天（DAF）]采自30年生的梨树（P. bretschneideri）（Cai等，2010），这些树种植于园艺场（中国安徽省砀山）。所有样品储存在−80°C以便后续RNA提取。 对于外源激素处理，39 DAF时收获的梨果实喷洒500 μM脱落酸（ABA）、500 μM甲基茉莉酸酯（MeJA）和200 μM水杨酸（SA）（Cheng等，2018）。所有样品在相同条件下处理。果实在激素处理后0、1、2和3小时收集，并冷冻于液氮中备用。 拟南芥植物在生长室中培养，条件为23°C，16/8小时光暗循环（持续光照强度为100 μE m⁻²s⁻¹）。每个品系种植了10株，每组挑选三株生长相似的植物进行进一步分析。

2.2. RNA提取及qRT-PCR分析

从每个冷冻组织中提取总RNA，使用植物组织RNAiso-mate试剂盒（天根，中国）。在cDNA合成前，使用DNase I（Thermo Scientific, USA）处理RNA以避免基因组DNA污染。随后，根据厂家说明，使用SuperScript III逆转录试剂盒（天根，中国）从每1 μg RNA合成第一链cDNA。所有qRT-PCR引物使用Primer Premier 5.0软件设计（表S2）。我们选择了α-微管蛋白（编号：AB239680.1）作为qRT-PCR分析的内参基因（Wu等，2013）。qRT-PCR使用CFX96 Touch™实时PCR检测系统（BIO-RAD）进行。基因表达水平的相对变化通过2-△△CT法计算（Livak和Schmittgen，2001）。

2.3. 生物信息学分析

使用NCBI数据库（National Center for Biotechnology Information）进行同源序列搜索，并使用DNAMAN软件进行同源序列比对。使用ExPASy在线工具估算每个PbC4H蛋白的分子量（kDa）和等电点（pI）。系统发育分析使用MEGA 5.0并采用邻接法（Abdullah等，2018）进行。PbC4Hs的5′-非翻译区（UTR）上游1500 bp序列从梨基因组文件中获取（GigaDB Dataset - DOI 10.5524/100083 - Genomic data of the pear (Pyrus bretschneideri).），并使用PlantCARE数据库在线软件（Lescot等，2002）识别启动子区域中的潜在顺式作用元件。

2.4. 在酵母中的PbC4H表达与表征

首先，在PbC4H1和PbC4H3的上游引物5′端添加CACC，而下游引物保持不变，以便扩增的目标基因5′端含有CACC序列。PCR产物经胶回收后，连接到pEASY-Blunt Simple T载体中（Takara, Japan）。入口载体pENTR-PbC4H1/3的构建通过定向TOPO克隆技术（pENTR/D-TOPO载体，Invitrogen, USA）完成。随后，入口载体pENTR-PbC4H1/3通过Gateway LR Clonase酶（Invitrogen, USA）亚克隆到目标载体pYES-DEST52中。最终的pYES-DEST52-PbC4H1/3质粒使用Frozen-EZ酵母转化II试剂盒（Irvine, CA, USA）转化到酿酒酵母WAT11中，阳性克隆通过提取酵母质粒DNA并进行菌落PCR验证。 酵母细胞在含有2%葡萄糖的SD-U培养基中30°C培养，直至OD600值约为1.8。收集的细胞被转移至5 mL SD-U培养基中，在30°C培养6小时，直到OD600值约为0.6。最后，将反式肉桂酸加入酵母培养液中，细胞在30°C生长1小时。空白酵母为对照组。 随后，酵母培养液与等体积甲醇混合。超声处理30分钟后，高速离心（12,000 rpm，12分钟）收集上清液，并通过0.22 μm有机相膜过滤。反应产物通过HPLC（Agilent 1290）和C18柱（5 μm，250×4.6 mm）在30°C下以1 mL/min的流速进行分析。流动相A（含0.02%甲酸的水）和流动相B（100%甲醇）的梯度如下：0–5分钟，15%溶剂B；5–15分钟，15%–25%溶剂B；15–25分钟，25%–35%溶剂B；25–35分钟，35%–50%溶剂B；35–40分钟，15%溶剂B。化合物的洗脱在309 nm波长下进行监测。所有实验进行了生物学重复。

2.5. PbC4H1和PbC4H3的酶促分析

我们使用MgCl2准备了酵母的微体分级，方法参考之前的研究（Diesperger等，1974；Olsen等，2010）。悬浮液置于冰上约70分钟，然后以12,000 rpm离心12分钟。微体组分溶解在1.5-2.0 mL TEG缓冲液中（30%甘油，50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）。所有实验在冰上进行，所有缓冲液/溶液和离心机预冷至4°C。

PbC4H微体酶促反应溶液在100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，含有1 mM NADPH，在30°C孵育40分钟。底物浓度范围为3到100 μM。通过加入甲醇终止酶反应。酶反应后，高速离心（12,000 rpm，12分钟）收集微体组分，并通过0.22 μm过滤膜进行过滤，随后使用HPLC进行分析。

2.6. 植物表达载体的构建及转基因拟南芥的生成

PbC4H1和PbC4H3基因（GenBank: MF797912 和 MF797914）从梨果实中通过PrimeSTAR® Max DNA聚合酶（Takara, Japan）和相关的OMT-F/R引物对进行PCR扩增。PCR产物经胶回收后连接至pMD18-T载体（Takara, Japan）。使用Primer Premier 5.0软件设计含有限制酶位点（NcoI和SpeI）的引物（PbC4H-EF和PbC4H-ER）（表S3）。双酶切片段通过T4 DNA连接酶连接到pCAMBIA1304载体（GenBank: AF234300.1）中，生成PbC4H的真核表达载体（pCAMBIA1304-PbC4H1/3），随后转化到根癌农杆菌EHA105中。 拟南芥的遗传转化通过花浸法完成（Clough和Bent，1998）。正向转基因植物通过在含有潮霉素的MS培养基上发芽筛选，随后通过gfp特异性引物（表S4）和β-葡萄糖醛酸酶（GUS）染色进行进一步鉴定。

2.7. 拟南芥木质素含量测定及组织化学染色

收集生长约60天的拟南芥植株，去除叶片，在65°C下干燥48小时。拟南芥的木质素含量采用Anderson等（2015）的方法估算。 收集转基因和野生型拟南芥植株的花序茎段（距离底部约3 cm的部分），样本放置在含有95%甲醇、70%（v/v）乙醇和冰醋酸的溶液中12小时后嵌入石蜡中，使用RM 2018病理切片机进行切片。植物组织切片使用标准的盐酸吡咯红和甲苯胺蓝染色法进行染色（Pradhan和Loque，2014）。

2.8. 拟南芥中反式肉桂酸和对香豆酸含量的测定

拟南芥花序茎在液氮中研磨后，取80 mg研磨样本，混合800 μL 90%乙醇，在40°C下超声提取50分钟，随后以6000 rpm离心10分钟。收集上清液并在45°C蒸发，加入1 mL 100%色谱级甲醇溶解物质。溶液通过0.22 μm有机相过滤膜过滤，代谢物的分析按照Proestos和Komaitis（2013）的方法进行。

2.9. 统计分析

数据以3次生物学重复的平均值±标准偏差表示。显著性差异通过ANOVA结合事后检验（Student's t检验）确定。星号表示显著性差异（*P < 0.05；**P < 0.01）。

3. 结果

3.1. C4H基因的生物信息学分析

在本研究中，从梨基因组中鉴定了三个PbC4H基因，这三个基因之间的同源性为95.5%。编码的梨PbC4H蛋白长度为504个氨基酸，分子量介于57.58和57.69 kDa之间，理论等电点（pI）范围为9.06至9.39（表1）。推导的多肽序列与其他物种的C4H序列（如拟南芥、杨树和节节麦）具有80%以上的同源性。我们鉴定了细胞色素P450的特征性保守结构域，包括N末端的富含脯氨酸区域（(P/I)PGPx(G/P)xP），该区域可以优化酶相对于膜的方向。此外，还在C末端附近鉴定了保守的血红素结合基序（PFGVGRRSCPG），并在目标P450序列中检测到一些保守螺旋，包括I螺旋（AAIETT）和K'螺旋（AWWLANN）（图1）。这些序列中还存在三个P450底物识别位点（SRS）区域和两个ERR三联体（图1）。更重要的是，与II类N端序列相比，I类N端的长度和组成高度保守。然而，这些蛋白质N端的差异似乎并未影响它们的亚细胞定位（Renault等，2017）。

Table 1. Amino acid sequence analysis of PbC4Hs.

Proteins name	Gene ID	Length (aa)	Mw (kDa)	pI
PbC4H1	Pbr013141.1	504	57.58	9.36
PbC4H2	Pbr013138.1	504	57.63	9.09
PbC4H3	Pbr017290.1	504	57.69	9.06

 

图1. PbC4Hs与拟南芥（AAB58355）、杨树（AFZ78542.1）和节节麦（XP_003568699.1 和 XP_003574953.1）中的C4Hs的多重序列比对。细胞色素P450蛋白的保守结构域用下划线标出，ERR三联体用“★”标记，底物识别位点（SRSs）用黑色矩形表示。

越来越多的证据表明，C4H可以根据氨基酸序列的相似性以及N端和C端的保守性分为两类（Carocha等，2015；Renault等，2017）。为了研究三个PbC4H与其他陆生植物C4H的进化关系，构建了系统发育树（邻接树），结果显示三个PbC4H聚类为I类，并且与蔷薇科物种的C4H最为接近（图2）。

图2. 不同陆生植物C4Hs的系统发育树。三个PbC4H用圆圈（●）标示。分支点处显示了引导值。

3.2. 三个PbC4H基因的顺式调控元件分析

为了更好地理解PbC4H表达的调控机制，分析了PbC4H基因启动子区域的潜在顺式调控元件。鉴定出多种类型的应激反应元件，包括与干旱诱导相关的MBS、与光胁迫相关的MRE、与冷胁迫相关的LTR以及与防御和应激相关的富含TC重复序列。此外，还发现了与激素调控相关的元件，如CGTAC基序、ABRE和TCA元件，分别与MeJA、ABA和SA反应有关。更重要的是，每个PbC4H基因都含有一个或多个AC元件，这被认为是与木质素合成相关基因的标志（Raes等，2003）。启动子区域中与次生细胞壁相关的顺式元件的存在表明，PbC4H基因可能参与梨的木质化过程。

3.3. PbC4H基因在不同组织中的表达模式

任何基因的功能都与其表达密切相关（Li等，2019）。因此，我们评估了PbC4H基因在不同植物组织（叶片、茎、花和芽）中的表达，以识别可能参与木质化的基因（图3）。结果显示它们的表达水平不同，表明它们可能在不同组织中具有功能活性。PbC4H1的转录水平在木质化组织（茎）中较高，而在相对较少木质化的组织（芽、叶和花）中较低。然而，PbC4H2在所有组织中的表达水平相似（各组织间该基因表达差异很小），PbC4H3的表达水平在芽、茎（木质化组织）和叶片中明显较高。与果实相比，PbC4H1和PbC4H3在茎、叶和花中的表达水平显著增加。然而，PbC4H2在芽和叶中的转录水平显著高于果实，在花中则最低。我们的结果表明，不同的PbC4H基因可能在特定组织的发育中发挥重要作用。

图3. PbC4Hs在梨不同组织以及梨果实发育过程中的表达模式 [开花后15、39、47、55、63、79、102和145天（DAF）]。误差条表示平均值 ± 标准差（n = 3）。符号和**表示与相应对照组相比的显著性差异 (P < 0.05 和 **P < 0.01，T检验)。

3.4. PbC4H基因在梨果实发育过程中的表达模式

通过qRT-PCR分析了PbC4H基因在梨果实发育过程中的表达模式（图3）。在梨果实发育过程中，石细胞数量和木质素含量迅速增加，随后逐渐减少，最高水平出现在开花后55天（Jin等，2013；Cai等，2010）。值得注意的是，两个PbC4H基因（PbC4H1和PbC4H3）的表达水平与梨果实中的石细胞数量和木质素含量的变化相关，表明它们可能参与了木质素沉积和梨果实中石细胞的形成。此外，PbC4H1和PbC4H3在两种表达分析中（比较木质素含量的组织和果实发育过程）都显示了预期的表达模式，表明这两个基因可能参与了梨果实中的木质化，特别是石细胞发育和木质素生物合成。

3.5. PbC4H基因对激素处理的差异表达

为了进一步研究与应激相关的激素处理如何影响PbC4H基因的表达，我们通过qRT-PCR分析了三种激素处理（ABA、MeJA和SA）下PbC4Hs的转录谱（图4）。ABA处理1小时后，三个PbC4Hs的表达达到峰值，然后显著下降，至3小时时达到最低水平（图4A）。在MeJA处理后，三个PbC4Hs的表达水平显著诱导。总体而言，这三个基因的表达在处理后1至3小时显著上升，在3小时时达到峰值（图4B）。在SA处理的梨果实中，PbC4H1和PbC4H2的表达水平显示出相同的趋势，处理1小时后显著下降，随后在2小时和3小时显著上升。然而，PbC4H3在SA处理后显著下降，且在3小时时表现出最低的表达水平（图4C）。总之，我们观察到三种应激反应激素（ABA、MeJA和SA）在不同程度上改变了这些基因的表达。此外，参与应激反应的旁系同源基因的反应可能与参与发育性木质化的基因不同。

图4. PbC4Hs在不同激素处理下的表达模式。(A) ABA处理的梨果实。(B) MeJA处理的梨果实。(C) SA处理的梨果实。HeatMap由Cluster 3.0和TreeView软件生成，使用激素处理后三个PbC4H基因的表达数据。使用基于log2倍数变化的数据生成热图。如右下角的颜色条所示，基因转录水平在热图中以不同颜色表示。数据以3次重复的平均值表示。

3.6. 重组PbC4H1和PbC4H3的功能表征

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11菌株是CYP450表达的理想选择，因为它含有CYP活性所需的还原酶（Pompon等，1996；Olsen等，2010）。为了进一步研究PbC4H1和PbC4H3是否具有催化活性，它们的重组蛋白在酵母（S. cerevisiae WAT11）中表达（图S2），并在粗酶系统中加入底物反式肉桂酸以评估PbC4H1和PbC4H3的酶活性。结果表明，当将反式肉桂酸底物加入到酵母WAT11 [pYES-PbC4H]的培养液中时，出现了一个新的产物峰（图5B），其色谱特征与对香豆酸标准品一致。图5C显示，在酵母中表达的重组PbC4H1和PbC4H3蛋白具有肉桂酸4-羟化酶的生物功能。为了进一步研究PbC4H1和PbC4H3对底物的亲和力，我们分离了酵母微体，并在磷酸缓冲液（50 μM，pH 7.0）中，在30°C孵育40分钟后测定了PbC4H1和PbC4H3的酶动力学参数。基于米氏-曼腾饱和曲线，PbC4H1和PbC4H3的相应Km值分别为10.23 μM和12.46 μM（图S3）。

图5. 酵母中PbC4H1和PbC4H3蛋白活性的分析。(A) pYES-DEST52-PbC4H表达载体。(B) PbC4H反应产物的HPLC谱图。(a) 对香豆酸标准品，(b) pYES空载体转化株，(c) pYES-PbC4H载体转化株。检测波长为309 nm。(C) PbC4H催化反式肉桂酸羟化为对香豆酸。

3.7. PbC4H在拟南芥中过表达增加了细胞壁厚度和木质素含量

由于梨的稳定遗传转化系统还处于初期阶段，难以在梨中对PbC4H基因进行功能分析。因此，这些基因在拟南芥中过表达，以评估其在植物体内的功能。在构建真核表达载体后，生成了三个独立的过表达PbC4H（PbC4H1-OE和PbC4H3-OE）的转基因拟南芥品系，并评估了转基因与野生型拟南芥植物中内源C4H的表达水平（图S1）。我们使用乙酰溴法测量了拟南芥花序茎的总木质素含量。结果清楚地表明，过表达PbC4H的植物的总木质素含量显著高于野生型植物（图6）。

图6. 拟南芥花序茎木质素含量的测量。星号表示与野生型植物相比的显著差异（*P < 0.05）。WT: 野生型植物，PbC4H1-01-03: PCAMBIA1304-PbC4H1转基因拟南芥，PbC4H3-01-03: PCAMBIA1304-PbC4H3转基因拟南芥。误差条表示平均值 ± 标准差（n = 3）。

为了直接观察转基因拟南芥植物花序茎中木质素的原位分布，我们对拟南芥花序茎进行了Wiesner（吡咯红-HCl）组织化学染色。Wiesner染色结果表明，PbC4H1和PbC4H3过表达系的茎中的木质部和导管间纤维相比野生型植物显示出更强的吡咯红染色反应（图7）。此外，我们通过甲苯胺蓝染色法评估了拟南芥花序柄某区域的细胞壁厚度（图8）。PbC4H1和PbC4H3过表达的转基因拟南芥在该区域的细胞壁厚度显著厚于野生型植物。两项染色实验的结果表明，PbC4H1和PbC4H3能够增加导管间纤维和木质部中的木质素合成和细胞壁厚度。

图7. 拟南芥花序茎的Wiesner横切染色。(A) PbC4H1转基因植物。(B) PbC4H3转基因植物。(C) 野生型（WT）植物。F: 导管间纤维，X: 木质部；比例尺 = 51 μm。

图8. 拟南芥花序茎的甲苯胺蓝横切染色。(A) PbC4H1转基因植物。(B) PbC4H3转基因植物。(C) 野生型（WT）植物。F: 导管间纤维，X: 木质部；比例尺 = 100 μm。（有关本图例中颜色引用的说明，请参阅本文网络版。）

3.8. 转基因植物中对香豆酸和肉桂酸含量的分析

作为梨果实中木质素合成的重要中间体，对香豆酸与木质素合成和石细胞的形成密切相关（Tao等，2009）。研究表明，增加对香豆酸含量会导致茴香醛和丁香醛水平的增加，最终促进青蒿（Artemisia annua）中木质素含量的增加（Kumar等，2016）。为了阐明转基因拟南芥植物中肉桂酸和对香豆酸含量的变化，我们通过HPLC对确认的转基因T3植株的肉桂酸和对香豆酸水平进行了比较分析（图S4）。结果显示，转基因植物中的肉桂酸含量低于野生型植物。相反，对香豆酸含量的变化呈现相反的趋势，转基因植物中对香豆酸的含量高于野生型植物（图9）。这一观察结果与大豆根中木质素积累的模式一致，在该模式中，肉桂酸含量的降低伴随着对香豆酸含量的增加，最终导致木质素含量的增加（Lima等，2013）。

图9. 转-肉桂酸和对香豆酸含量的测定。(A) 转-肉桂酸。(B) 对香豆酸。误差条表示平均值 ± SD（n = 3）。符号 * 表示转基因植物与野生型植物之间的显著差异 (*P < 0.05)。

4. 讨论

石细胞的含量和大小是影响梨果实质量的重要因素（Li等，2017；Jin等，2013），而木质素对石细胞的形成有重要影响（Cai等，2010；Tao等，2015）。木质素的形成受控制于木质素单体的运输和聚合所需的酶。作为木质素合成的关键酶，C4H在拟南芥中的作用已得到证实。因此，筛选和鉴定参与木质素合成的PbC4H基因对研究梨果实中的木质素合成和石细胞发育具有重要意义。 在构建的系统发育树中，C4H的I类和II类均被聚类，这与之前的研究结果一致，即C4H在大多数陆生植物的基因组中高度保守（Renault等，2019）。这一观察表明，C4H在陆生植物进化过程中是保守的。不同陆生植物中C4H的数量也有所不同。在棉花中鉴定了两个C4H，而在丹参中只鉴定了一个C4H，而喜树和银合欢的C4H则以多基因家族的形式存在（Kumar等，2013；Li等，2016；Huang等，2008；Sadeghi等，2013）。在本研究中，在白梨中鉴定了三个C4H基因，且这三个编码蛋白之间的同源性为95.3%。已有研究表明，C4H在I类和II类中具有不同的功能。I类C4H在需要苯丙素类代谢产物的任何组织中会持续表达（Harakava，2005）。I类和II类C4H酶在相关植物组织中可以执行相同的典型功能（肉桂酸4-羟化），但可能具有不同的膜拓扑结构（Renault等，2017）。 启动子可以通过协调多种顺式作用元件和反式作用因子来调控基因表达（Soliman和Meyer，2019）。在PbC4H的启动子区域预测到几种重要的植物激素响应元件（表S1），这表明这些基因的转录可能受这些植物激素的调控。尽管至今尚未报道ABA和MeJA对梨果实细胞发育的影响，但SA可以通过诱导微RNA的表达来调节梨果实的木质素合成和石细胞发育（Xue等，2018）。我们的研究结果表明，这些激素可能也会直接或间接调控PbC4H的转录，从而影响梨果实的石细胞发育。有趣的是，并不是所有的PbC4H启动子都含有响应这些激素的元件（例如，PbC4H3的启动子中缺乏SA响应元件）。然而，PbC4H3的转录水平仍然受到SA处理的影响（图4）。植物激素之间的相互作用可能促进协同效应，使激素相互诱导（Berens等，2017）。因此，我们认为喷洒某种激素可能导致另一种激素含量的增加，从而影响基因表达。此外，在PbC4H的启动子中还鉴定出光响应元件（MREs）（表S1）。越来越多的证据表明，套袋处理改变了梨果实的木质素和石细胞含量（Tao等，2015；Wang等，2017），我们推测PbC4H表达的变化是这一现象的原因之一。 我们还发现PbC4H的启动子区域含有响应生物和非生物胁迫的顺式元件（表S1），这表明PbC4H可能在应对不同的生物和非生物胁迫中发挥不同的作用。此外，一些转录因子会影响C4H的转录水平。例如，拟南芥中的AtMYB4可以负调控AtC4H的表达，并减少叶片中酯类物质的水平（Jin等，2000）。过表达来自金鱼草的MYB基因可以抑制C4H的转录，并降低转基因烟草中的酚酸和木质素含量（Tamagnone等，1998）。AC元件与木质素相关的MYB转录因子结合以激活木质素生物合成基因的表达（Patzlaff等，2010）。有趣的是，我们观察到所有PbC4H基因的启动子中都含有丰富的AC元件。因此，这些基因可能都与梨中的木质素代谢有关。 我们之前的研究结果显示，梨果实中的石细胞含量在开花后39至63天迅速增加，然后成比例减少，最高峰出现在开花后55天（Jin等，2013；Cai等，2010）。有趣的是，PbC4H1和PbC4H3的表达模式与石细胞含量的变化趋势一致（图3），表明这两个PbC4H可能在梨果实中的木质素生物合成和石细胞发育中发挥重要作用。考虑到PbC4H在不同组织中的表达模式，我们推测PbC4H1和PbC4H3可能在石细胞的生长和木质素的生物合成中起关键作用。此外，我们还发现PbC4H1的表达在开花后145天（成熟期）增加。这可能是由于C4H参与了苯丙素类代谢途径，不仅影响了木质素的合成，还参与了芳香化合物和黄酮类的合成（Kim等，2014；Fu等，2011）。 我们使用S. cerevisiae真核表达系统验证了PbC4H1和PbC4H3的功能（图5）。结果显示，在酵母中表达的重组蛋白具有酶活性，表明这些关键蛋白是功能性的。因此，这些结果也为梨果实木质素生物合成中的关键基因的酵母表达及代谢工程菌株的构建提供了技术思路。 一些酶在木质素生物合成中的作用已被明确。在某些情况下，适当的遗传操作已被用于改变木质素的组成或减少植物中的木质素含量（Weng和Chapple，2010）。Sykes等（2014）观察到，在C4H表达受到抑制的植物中，总木质素和木质素单体含量显著减少；这些植物的木质素组成也发生了变化。然而，关于梨果实木质素合成中的C4H知之甚少。为了验证梨C4H的实际功能，我们在拟南芥中过表达了PbC4H1和PbC4H3，以进一步分析它们在木质素合成中的作用。我们的结果显示，PbC4H1和PbC4H3的过表达为这两个基因参与木质素代谢提供了遗传证据。 近年来，代谢组学研究揭示了木质素合成和单木质素代谢的一些新方面（Supaporn等，2018；Chapelle等，2012；Dima等，2015）。液相色谱技术主要用于鉴定木质素生物合成途径中的酚类化合物（Supaporn等，2018）。与其他中间体一样，对香豆酸对于木质素的合成至关重要（Cai等，2010）。在本研究中，基于肉桂酸作为底物，对香豆酸作为其靶酶的产物，我们通过液相色谱定量分析了PbC4H1和PbC4H3过表达系中的代谢物。研究结果表明，PbC4H的表达增加可能导致肉桂酸向对香豆酸的转化增加，而对香豆酸可能用于下游木质素合成途径。这一发现表明，研究人员可以通过调节PbC4H的表达水平来改变梨果实中的对香豆酸含量，从而调控木质素合成和石细胞发育，最终改善梨果实的质量。

5. 结论

本研究鉴定了梨基因组中的三个C4H基因。这三个PbC4H的氨基酸序列与多个物种的典型C4H具有较高的同源性，并含有典型的细胞色素P450结构域，表明这三个PbC4H与其他陆生植物的C4H具有密切的进化关系。外源激素（ABA、MeJA和SA）在不同程度上改变了这些基因的表达。表达谱分析显示PbC4H1和PbC4H3可能是梨果实中木质素合成的关键基因。在酵母中表达的重组PbC4H1和PbC4H3蛋白催化了转-肉桂酸向对香豆酸的转化。此外，在拟南芥中过表达PbC4H1和PbC4H3为这两个基因参与木质素代谢提供了遗传证据。本研究为梨果实中木质素合成和石细胞发育的分子调控机制提供了新的见解。