文献组会汇报：超氧阴离子响应机理以及核探针设计（二）

药物化学生物学小组共用账号

已于 2024-11-25 09:43:43 修改

阅读量2.9k

点赞数 19

分类专栏：荧光探针设计药物化学有机合成文章标签：人工智能卷积神经网络线性回归

于 2024-11-18 16:43:09 首次发布

本文链接：https://blog.csdn.net/weixin_48893315/article/details/143857248

版权

有机合成同时被 3 个专栏收录

12 篇文章

订阅专栏

药物化学

10 篇文章

订阅专栏

荧光探针设计

7 篇文章

订阅专栏

一、超氧阴离子的生理学意义：

参考文献：Advancements in Small Molecule Fluorescent Probes for Superoxide Anion Detection: A Review | Journal of Fluorescence

Chen课题组发表了一篇关于超氧阴离子的综述。超氧阴离子（O2•−）是生物系统中一种重要的活性氧（ROS），在细胞功能调节中起着广泛的作用，与许多疾病的发生和发展密切相关。为了揭示O2•−在这些疾病中的病理意义，生物系统内有效监测技术的发展势在必行。

活性氧（ROS）包括细胞内一系列氧反应物质，包括超氧自由基阴离子（O2•−）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）、单重态氧（1o2）和过氧亚硝酸盐（ONOO−）。它们在维持细胞氧化还原平衡方面发挥着至关重要的作用，它们的产生和消除受到一系列抗氧化防御机制的精细调节。

1.常见的荧光电子转移机理以及激发后发射荧光的方式：

主要的传感机制可分为几类：分子内电荷转移（ICT）、光诱导电子转移（PET）、荧光共振能量转移（FRET）、激发态分子内质子转移（ESIPT）。

1.1 ICT电子效应：

其中ICT荧光分子主要通过硝基、羰基氰基等吸电子基团同时附着在荧光基团上，形成“推拉”电子系统。共轭系统的增长或减少会导致探针的红移或者蓝移。

1.2 PET 光致电子转移效应：

PET光致电子转移效应是在激光的作用下分子内的电子转移过程。利用PET机制设计的探针通常具有高量子产率以及含有电子给体原子（N,O,Te,Se）的识别集团组成。识别集团将电子从给体原子转移到激发的空轨道上，导致荧光淬灭。在与分析物相互作用之前，探针分子在一定波长下没有荧光或者具有较低的荧光。与分析物反应后，PET过程被抑制，荧光团恢复荧光。

1.3 FERT型荧光共振能量转移电子效应：

荧光共振能量转移FERT探针由中间体通过连接两个不同的荧光团组成，FERT现象需要满足两个条件：①一个荧光团的发射的光谱和另一个荧光团发射的光谱重叠。②两个荧光团分子之间应保持1~10nm之间的间距。FERT机制常用于设计比率型荧光探针。

1.4 ESIPT型分子内质子转移电子效应：

激发态分子内质子转移机理是指当探针分子受到光激发的时候，分子内电子从基态跃迁至激发态，内部质子供体如OH和NH2与相邻的氢键受体形成N,S,O分子内五元环或者六元环，从而导致分子内共轭发生较大改变，从而引发光谱红移。

2. 超氧阴离子产生的生理学基础以及产生的相关疾病：

超氧阴离子（O2•−）是体内产生的初始活性氧（ROS）。线粒体中的氧气主要来源于线粒体，由于电子呼吸传递链的单电子泄漏，大约2%的线粒体氧气被还原为O2•−。O2•−经过酶促或非酶促催化，形成各种对生理功能至关重要的活性氧。

在超氧化物歧化酶（SOD）的快速自猝灭作用下，O2•−转化为相对稳定的H2O2。这种转化导致两种结果：通过碳酸酐酶（CAT）或谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）产生水分子。Fenton反应在Fe2+/Cu+离子存在时发生，生成高活性的•OH。此外，H2O2在髓过氧化物酶（MPO）的催化下生成HOCl。O2•−也与一氧化氮自由基（NO•）发生非酶性反应，生成ONOO−，ONOO−可分解为NO和•OH[43]。因此，监测O2•−水平可以在一定程度上作为评估其他ROS水平变化的指标。

在体内，O2•−的稳态浓度控制着细胞信号转导，并复杂地参与细胞的生命周期[45]。它的关键作用包括参与细胞增殖、分化和免疫应答等功能。然而，升高的O2•−水平可构成有害威胁，作为一种毒素，通过氧化脂质、DNA和蛋白质，从而诱导细胞内的氧化应激。这种应激与各种疾病的发生和发展密切相关。过量的O2•−产生导致线粒体功能障碍，影响大脑中淀粉样蛋白的沉积，被认为有助于阿尔茨海默病的发展。

3.超氧阴离子的响应方式以及各个探针的设计思想：

3.1基于三氟甲基磺酸盐的探针设计：

3.1.1 基于二氰异弗尔酮的超氧探针设计：

参考文献： Construction of a super large Stokes shift near-infrared fluorescent probe for detection and imaging of superoxide anion in living cells, zebrafish and mice - ScienceDirect

Wang等人利用二氰异弗尔酮衍生物作为荧光基团，三氟甲烷磺酸盐作为O2•−的特异性识别位点，构建了一种“Turn-On”的化学敏感近红外荧光探针。在O2•−的亲核攻击后，释放荧光团，增强ICT效应，产生更强的近红外荧光发射。该探针具有①260nm高toke位移②低细胞毒性③能够检测炎症小鼠的O2•−生成④149nM超低检测限。

该探针由于两端都具备较强的吸电子基团，从而导致分子内部无法形成“推拉”式结构。超氧阴离子通过和三氟甲磺酸酐亲核进攻实现强的ICT效应。

通过理论计算显示，DCM-Cu-OTf和DCM-OH的HOMO-LUMO间隙分别为2.88eV和2.82eV，说明DCM-Cu-OH的能量间隙减少，ICT效应增强，紫外吸收发生红移。LUMO和HOMO图中红色代表相对缺电的基团，绿色代表相对富电的基团。可以从LUMO的图中观察到分子内整体的电子向着右侧转移。通过偶极矩计算可得，Dcm-Cu-OH偶极矩（μ = 8.4187）大于Dcm-Cu-OTf偶极矩（μ = 5.0212）。

紫外吸收所示，DCM-Cu-OTf的最大吸收波长在405nm附近，而与20equiv.的O2·-响应之后，吸收峰红移到720nm左右。我们通过720nm的激发波长对探针和响应后的探针的PH耐受性进行测量，发现激发后的探针可以在PH=7~10具有225倍荧光强度。后续在720nm处进行荧光滴定实验，使用10μM的探针，从0μM不断增加到200μM，对0~20μM的荧光强度进行线性统计，发现其在20μM下的线性良好。

使用710nm的波长激发不同200μM的生物干扰物（ 1, blank; 2, Na+; 3, K+; 4, Ca2+; 5, Zn2+;6, NO3 ;7, AcO ; 8, S2; 9, S8;10, S2O3; 11, SO3; 12, SO4; 13,GSSG; 14, CH3SSSCH3; 15, Thr; 16, Phe; 17, Ser; 18, Glu; 19, Gly; 20, Lys; 21, Arg; 22, His; 23, Tyr; 24, Val; 25, Ala; 26,
Pro; 27,Cys; 28, Hcy; 29, GSH; 30, H2O2; 31, NO; 32, ClO ; 33, HO•; 34 1O2; 35, NO2; 36, ONOO; 37 O2），发现该探针对O2`-的响应良好。

3.1.2基于内酰亚胺的高尔基体铁死亡超氧阴离子探针设计：

参考文献：Golgi apparatus-targeting fluorescent probe for the imaging of superoxide anion (O2•−) in living cells during ferroptosis - ScienceDirect

Yue课题组设计了一种高尔基体的超氧阴离子探针。铁死亡是一种新型的铁依赖性细胞死亡方式，最近被证明和高尔基体息息相关。Yue课题组设计了一种关于高尔基体铁死亡的N-GA，N-GA使用一个三氟酸酐基团和一个十四烷酰胺单元作为O2`-和高尔基体的靶向单元的识别单位。

前期研究发现高尔基应激诱导剂（如brefeldin A）可诱导人细胞铁死亡，可通过上调GPX4(小鼠谷胱甘肽过氧化物酶)表达和抑制ACSL4（脂质代谢酶）来阻止这一过程。目前，推测应激诱导剂通过高尔基分散和过量生成O2•-触发铁死亡。高尔基体分裂之后，会造成细胞内的抗氧化辅酶q10的损失和耗尽，并且会促进相关蛋白NOS10产生O2`-，随后出现大量脂质体ROS。

目前出现了大量关于超氧化合物检测的探针，但是高尔基体的超氧监测探针仍然十分缺乏，对于内源性O2`-的监测暂时还缺少相关的方法。作者通过利用十四烷酰胺基团作为高尔基体的靶向单元，而内酰亚胺和三氟甲磺酸酐都具有强吸电左右，通过三氟甲磺酸酐对高尔基体内的O2`-响应后形成ICT电子转移机理，发绿光。

首先测量探针5μM N-GA的紫外吸收，然后先分别加入50,100,150,200 μM的O2`-，观察紫外的变化状况。探针本来在可见区没有什么吸收峰，随着加入200 μM的O2`-，出现了383nm和458nm的吸收峰，表明N-GA和O2`-发生了反应。加入O2`-先后，溶液由无色变味了淡黄色。随着响应物浓度不断增强，两个吸收峰的浓度不断上升。随着使用572nm激发先后加入0，3，6，9，12，15，20，25，30，40，50，75，100，125，150，175，200，225，250μM的O2`-，荧光强度不断增强，并且在0~15μM的O2`-的荧光滴定呈现良好线性。对其他干扰物在572nm处进行荧光激发除了GSH、Ca2+，Mg2+使用1mM其他分析物采用100μM。

3.2 基于二苯基磷酸基团的探针设计：

3.2.1 基于磷酸盐设计的双光子荧光探针：

参考文献：Two-Photon Fluorescence Probe for Selective Monitoring of Superoxide in Live Cells and Tissues | Analytical Chemistry

超氧阴离子的异常位置或产生与包括癌症在内的许多疾病有关；因此，开发一种有效的方法监测 $O_2^.-$ 是非常重要的。受到先前基于磷酸盐的荧光探针对 $O_2^.-$ 和过氧亚硝基盐 $ONOO^-$ 的启发，设计的TPP对 $O_2^.-$ 的敏感性远超其他活性氧/氮物种。

目前关于 $O_2^.-$ 的许多探针被开发出来，如荧光素2-（苯并噻唑-2-基）-苯酚（HBT）、半胱氨酸、二苯并[a,c]-非那嗪、萘酰亚胺等。在先前的探针中，磷酸盐基团对过氧亚硝基基团具有特异性，在此驱动下，Fan课题组猜测将磷酸盐转变为硫代磷酸盐是否对 $O_2^.-$ 具有高反应性，或者对ONOO-产生特异性反应。

之前设计的探针存在合成过程复杂、选择性较弱（相较于 $O_2^.-$ ），并且许多弹奏在单光子显微镜中应用有限，存在光漂白、生物自身荧光以及由于激发波长短而组织穿透度低的问题。双光子探针由于两个近红外（NIR）脉冲激发，克服了上述的问题。

在选择性实验中，使用DMSO溶解了 $KO_2$ 用于制备超氧化物溶液 $O_2^.-$ 。其余响应物在超纯水中稀释70%的过氧化叔丁基、5%的NaClO和30%的H2O2，制备过氧化叔丁基（THBHQ）、次氯酸（HOCl）和过氧化氢（H2O2）溶液。在超纯水中制备谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、硫化氢（H2S）和NO2−溶液。将过氧化氢（H2O2, 100 μM）加入到硫酸铁铵（100 μM）溶液中，生成羟基自由基（•OH）。将H2O2原液加入10等量的HOCl溶液中制备单线态氧(1o2)。