细胞共定位实验

一、荧光共定位的原理：

        激光扫描共聚焦显微镜在生命医学研究中广泛应用，通过共聚焦显微镜获取的图片可进行共定位分析。生物学上荧光共定位（Colocalization）指两个或多个不同分子位于细胞中的同一结构，常用来研究两个荧光分子在组织或者细胞中的位置关系以及可能存在的相互作用。

二、细胞共定位前期步骤：

1.细胞准备：

        在六孔板中每个孔准备3*10^5个细胞，培养约24h（1.5×10*5）。随后在准备拍照前的两个小时前，将配好的探针（10uM）和Hoechst-33342(A1-A4),ER-Tracker Green(B1-B4), Mito-Tracker Green (C1-C4)或Lyso-Tracker Green(D1-D4)准备好，在没有灯光的条件下配置探针母液（自己合成的探针终浓度一般为10uM），并从终浓度10uM倒推所需的中间溶液的浓度以及体积（200ul,保守起见取300ul），再从中间体积以及浓度倒推母液的体积（一般母液浓度为10mM）。

        随后，做好细胞实验前的准备步骤，①然后用5ml的枪将六孔板中的培养基吸出，使用PBS将每个孔清洗两遍，加入配置好的中间溶液（含有培养基的探针溶液），第一次加中间溶液是自己合成的探针，晃一晃保证中间溶液均匀分布。放入培养箱，计时半个小时。②吸取刚刚加入的培养基，再次用PBS洗两次，加入商业染料中间溶液，晃一晃，孵育半个小时。③半小时后取出，PBS洗两遍，加入培养基，加入完成后使用锡箔纸包裹。

         出发前需要在框内检查需要携带的东西：PBS（用于清洗盖玻片上多余的培养基），用于清洗的六孔板（用于装PBS），酒精、擦镜纸（用于开机擦酒精），滤纸（用于擦配置好的片），餐巾纸（用于沾从培养基中带出来的盖玻片上的液体）、两个针头（勾培养基以及滴防荧光淬灭液）、玻璃片（用于放玻璃片）、防荧光淬灭液、镜油、实验记录本、废液缸。

        Leica荧光摄像机的拍摄严格按照墙上的要求进行，进入

        配成染色30 min 共聚焦荧光图片。（ Hoechst 33342: λex/λem = 405 nm/445 ± 25 nm; ER-Tracker Green, Mito-Tracker Green, Lyso-Tracker Green: λex/λem = 488 nm/525 ± 25 nm。比例尺：25 μm。）

        本次实验是验证嫁接的基团是否会影响探针的核定位能力，我们选取了商品化细胞核探针Hoechst 33342 作为参考(DNA靶向探针)，在亚细胞器共定位实验中，HepG2 细胞用合成的核探针和Hoechst 33342 一起孵育30 min，然后进行成像。核探针的红色荧光信号与Hoechst 33342 的蓝色荧光信号可以很好地重叠，皮尔森共定位系数（Pearson's colocalization coefficients, PCC）较高。作为对照，我们还选取了内质网绿色荧光探针ER-Tracker Green、线粒体绿色荧光探针Mito-Tracker Green、溶酶体绿色荧光探针Lyso-Tracker Green 分别和核探针一起孵育。

        核探针的红色荧光信号与探针ER-Tracker Green、Mito-Tracker Green 和Lyso-Tracker Green 的绿色荧光信号几乎不重合，计算所得皮尔森共定位系数分别为-0.15，-0.21，-0.14。

三、后期处理软件ImageJ的使用方法：

1. 图像获取：

        图像应以顺序扫描方式获取以消除荧光的交叉干扰和确保共定位的可靠定量，并以Tiff格式进行保存防止信息丢失。

2.背景矫正：