病原微生物高通量测序:第三节 检测原理

临床微生物高通量检测,应用场景不同,各种测序技术令人眼花缭乱,但我们可以做如下总结。

  1. 检测对象:病原体核酸,或人宿主自身核酸

  2. 测序技术:DNA 测序,或 RNA 测序

  3. 测序范围:DNA 靶向,或 DNA 非靶向;所有 RNA,或部分 RNA

进而可以归纳为两大类,四小类测序策略。

  1. 以微生物核酸为检测对象:

  • 病原基因组测序(metagenomic)

  • 病原转录组测序(metatranscriptomic)

  • 以人宿主自身核酸为检测对象:

    • 人基因组测序(DNA-Seq)

    • 人转录组测序(RNA-Seq)

    目前,”病原微生物基因检测“约等于”病原宏基因组检测“,正如“精准医疗”约等于“肿瘤基因检测”一样。

    作为宏基因组的补充,基于多重 PCR 的靶向测序,具有非常大的应用情景。

    而其他技术,如宏转录组、RNA-Seq 研究病原与人的互作等目前都还处于探索阶段。

    1. 非靶向测序(untargeted NGS,mNGS)

    非靶向的宏基因组测序,优势是大而全,不管有多少种微生物感染,理论上都一次给测出来。不仅能测已知病原,还能发现未知病原体。

    但是它最大的缺点,就是灵敏度严重依赖于受背景干扰的程度。特别是组织样本,含有大量人体细胞,测出来的数据 99% 都是人的 DNA 序列。

    因此可以说,宏基因组测序,就是大海捞针。而靶向测序,则可与之互为补充。

    2. 靶向测序(targeted NGS, tNGS)

    靶向扩增子测序是先富集目的 DNA 序列,再测序。这样可以增加测序数据中目标序列的比例,进而提高检测的灵敏度。

    常用于富含 DNA 的手段有扩增和捕获两种。

    扩增: 通过 PCR 反应增加目的片段的数量。

    捕获: 通过核酸探针与目的片段进行杂交,从而抓取目的序列进行测序。

    显然,靶向测序只能用于核酸序列已知的病原体的检测。其好处是灵敏度高、成本低。

    参考文献:

    Chiu C Y , Miller S A . Clinical metagenomics[J]. Nature Reviews Genetics, 2019.


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