2020.9.9丨微生物多样性、宏基因组测序原理

• 微生物多样性测序原理及案例解析
  • 研究对象
    • 人类：口腔、皮肤、粪便、肠道...
    • 动物：瘤胃、肠道…
    • 植物：菌根、内生菌...
  • 历代测序原理
    • 一代测序
      • 双脱氧链终止法
        • 正常的DNA碱基是四种脱氧核糖核苷酸（dNTP），如果将这个碱基稍加改造，将一个-OH的氧去除，变成-CH2，就变成了一个双脱氧的核糖核苷酸（ddNTP）。在DNA合成的过程中加上这个ddNTP，由于ddNTP无法和下一个碱基链接，DNA链将无法继续延伸。
        • 缺点：成本高、通量低
    • 二代测序
      • PCR扩增阶段，将加好接头的待测DNA借助接头固定到一个叫flowcell的芯片上，由于两端同时固定扩增时待测序列成桥状也被成为桥式扩增，PCR反应后模板周围产生扩增产物聚集的一个个单克隆的DNA簇‘
      • 二代微生物多样性
        • 细菌
        • 真菌
        • 微生物功能基因
          • 细菌微生物多样性
            • 16S rDNA：编码原核核糖体小亚基rRNA的DNA序列。在结构上分为保守区和可变区。保守区反映生物物种间的亲缘关系，可变区反映物种间的差异。
          • 真菌微生物多样性
            • ITS1：位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间，ITS区域进化速率是18S rDNA的10倍之多。
          • 微生物功能基因多样性
            • 土壤生物地球化学过程相关的功能基因多样性固氮（nifD,nifH）、硝化与反硝化（norZ,norB）氨氧化细菌、氨氧化古菌（amoA,amoB）
        • 百迈客二代微生物多样性测序区域汇总

          

  • 全长微生物多样性产品类型
    • 16S全长
    • 18S全长
    • ITS全长
    • 产品优势

      

    • 建库方式
      • 微生物DNA提取--目标区域PCR及纯化--PCR产物文库制备（加Barcode）--Hiseq2500/Pacbio上机测序
    • 数据处理
      • PE250双端测序---读取碱基序列各250bp---通过overlap拼接---得到tags聚类---得到OTU--OTU比对数据进行分析      
    • 研究目的
      • 1、鉴定环境样品中微生物在门、纲、目、科、属、种水平的分类；
      • 2、检测环境样品中微生物在各分类水平上所占的相对比例即丰度；
      • 3、比较不同处理样品中微生物群落结构的差异，各样品中优势菌种；
    • 数据分析内容 
      • 基本分析与高级分析

        

    • 多样性云平台优势
      • 高效
      • 快速
      • 自由分析
  • 案例解析
    • Melatonin prevents obesity through modulation of gut microbiota in mice
    • Metagenomic analysis of the bacterial communities and their functional profiles in water and sediments of the Apies River, South Africa, as a function of land use
  • 送样要求-农学
    • u土壤：每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g，若土壤含微生物较少，需增加送样量
    • u淤泥：4小时内常温带回实验室中分装至2mLEP管或冻存管中；或用PBS进行清洗，8000g离心10min收集沉淀，分装于2 mL离心管中；每个样品至少2g。
    • u水体：2ml-5ml水体，取样后4小时内（期间4 ℃避光保存）真空抽滤、富集菌体（平行重复样本可用同一滤膜过滤0.22μm或0.45μm）带有富集菌体的干燥滤膜剪碎或折叠后保存在 2mL或5mL 无菌EP管中。
    • u肠道内容物：在实验对象死亡后，无菌条件下，取出整个肠道，用无菌解剖刀切取所需肠段的内容物。用无菌手术刀挖取内容物，并立即放在冰上进行分装及标记。将已取的样品分装至2mLEP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管组织量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份。
    • u粪便：带上手套收集新鲜的粪便样品，无菌牙签或粪便取样器截取样品中段内部（避免表层中的肠道膜脱落细胞），外部容易污染且细菌DNA由于接触空气可能有降解，将已取的粪便样品分装至2mLEP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管粪便量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份。
    • u所有样本，液氮速冻，-80℃保存，干冰运输                                                 生物学重复  ≥   3
    • uDNA样本：

      

• 宏基因组测序原理及案例解析
  • 宏基因组
    • 环境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和不可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
  • 技术优势
    • 宏基因组不依赖于微生物的分离培养，克服了传统的纯培养方法的技术限制，并可研究不可培养的微生物
    • 可以得到环境中丰度较低的，甚至是微量微生物的信息，为研究低丰度微生物提供了途径
    • 宏基因组学引入了宏观生态的研究理念，对环境中微生物菌群的多样性、功能活性等宏观特征进行研究，可以更准确  地反应出微生物生存的真实状态
  • 建库流程
    • 流程图

      

  • 基因组组装
    • ContigN50
  • 技术研究路线
    • 二代测序平台：Xten/Nova    PE150   350bp文库
    • 技术路线图

      

      • (1)去除PCR扩增的完全一致的reads
      • (2)trimmomatic去除低质量的reads
      • (3)bowtie2比对宿主去除宿主污染
    • 物种多样性和功能多样性
    • 微生物专用数据库
      • CARD-抗生素抗性基因数据库
  • Nanopore测序原理（略）
  • ONT宏基因组
    • 宏基因组是对环境样本中（土壤、粪便、肠道、水体等）微生物总DNA进行测序。关注环境微生物的种群结构、进化分析、功能基因；解析微生物功能与环境之间的关系；挖掘和研究特定功能基因及代谢通路。纳米孔测序技术能够对环境样本进行精确的微生物组分析。并且已经在宏基因组领域广泛应用。
    • 三代Nanopore宏基因组优势
      • 1、 提高物种鉴定的精准度
      • 2、 获得低丰度物种
      • 3、微生物更完整的基因组（无法分离培养菌）
      • 4、获得环境样本中细菌基因组草图（binning）
  • 宏基因组binning
    • 含义：分箱、聚类，指从微生物群体序列中将不同个体的序列（reads或contigs等）分离开来的过程。
    • contigbinning在常规宏基因组基础上，进一步将拼接的contig进行cluster聚类，可实现单菌的组装以及宏基因组关联分析（MWAS）分析。
    • 基于宏基因组数据的contigbinning分析，可基于宏基因组组装结果，将组成相似以及丰度分布模式一致的contig划分到同一物种，并进一步进行单菌的草图组装。从而可在基于单菌组装结果的基础上进行菌株水平的基因和功能注释、比较基因组分析、进化分析等。
  • 微生物多样性与宏基因组比较