天然有益菌--溶藻弧菌X-2降低海藻白化病发生的机制
Naturally occurring beneficial bacteria Vibrio alginolyticus X-2 protects seaweed from bleaching disease
Article, 2023-06-13, mBio, [IF 6.4]
DOI：10.1128/mbio.00065-23
原文链接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.00065-23
第一作者：Mingyu Ma（马铭宇）
通讯作者：Suhelen Egan；Gaoge Wang（王高歌）
合作作者：Yingrui Zhuang（庄英瑞）；Lirong Chang（常丽荣）；Luyang Xiao（肖露阳）；Qin Lin（林钦）；Qiying Qiu（邱其樱）；Defu Chen（陈德福）
主要单位：
中国海洋大学海洋生命学院（College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao, China）
中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所（Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao, China）
威海长青海洋科技股份有限公司（Weihai Changqing Ocean Science & Technology Co., Ltd, Rongcheng, China）
福建省连江官坞海产开发有限公司（Fujian Lianjiang Guanwu Seafood Developing Product Co., Ltd, Guanwu, China）
新南威尔士大学（Centre for Marine Science and Innovation & School of Biological, Earth and Environmental Sciences, The University of New South Wales, Sydney, New South Wales, Australia）
- 摘要 -
通过添加有益菌操纵微生物群落，可缓解由致病菌引起的宿主附生微生物群落的失衡，减少病害的发生，进而改善宿主的健康状况。然而，目前海藻有益菌的相关研究仍处于起步阶段，尚未厘清有益菌对海藻的保护机制。白化病是近年来海带育苗过程中爆发的一种细菌性病害。本研究从白化病海带藻体上筛选到一株能够显著降低海带白化病发生的有益菌--溶藻弧菌X-2。结合侵染实验与多组学分析证实，添加X-2可增加海带附生微生物群落稳定性、上调海带免疫和胁迫保护相关基因、下调光合能量合成相关基因、增加海带共生体中甜菜碱的含量，以降低白化病的发生。此外，本研究表明，在病害发生前应用有益菌可能是防控病害发生的关键。本研究为应用有益菌防控养殖海带病害的发生提供了科学依据。
- 介绍 -
有益菌已成功地应用到人类肠道疾病的治疗、水产养殖鱼类的病害防控、珊瑚白化的预防以及陆地作物的生产中。通过添加有益菌操纵微生物群落，一方面，可使失衡的微生物群落恢复至平衡状态，从而改善宿主的健康状况；另一方面，可引起宿主功能的改变，以海洋生物为例，向珊瑚中添加有益菌，在转录水平上，可引起珊瑚共生体应激保护相关基因的上调表达，以增强珊瑚的防御能力，而凋亡及免疫应答相关基因下调表达，以降低细胞损伤；在代谢水平上，可引起珊瑚共生体二甲基巯基丙酸降解，产生抗菌化合物，以抑制致病菌的生长和致病性，最终减轻珊瑚白化症状，并降低死亡率。此外，在一些水生动物中也观察到相似的变化，如有益菌可引起塞内加尔比目鱼和虹鳟鱼免疫和抗氧化反应相关基因的上调表达。
虽然海藻有益菌的相关研究仍处于起步阶段，但近期研究表明，已经筛选到了可促进海藻生长和/或提高抗病性的有益菌。例如，江蓠（Gracilaria conferta）表面的有益菌可以保护江蓠免受附生真菌的伤害；真江蓠（Agarophyton vermiculophyllum）的表面代谢物可吸引有益菌菌株黄海弧菌（Vibrio marisflavi），从而抑制致病菌杀藻科迪亚菌（Kordia algicida）的定殖，减少病害的发生。近期发现野生红藻Delisea pulchra有益菌Phaeobacter sp. BS52（BS52）能够显著降低致病菌Aquimarina sp. AD1（AD1）引起的白化病的发病率。16S rRNA基因高通量测序分析表明，BS52可调控D. pulchra附生细菌群落，并有效地缓解由致病菌AD1引起的藻体附生细菌群落的失衡，从而降低白化病的发生。然而，关于有益菌如何引起海藻宿主免疫防御反应的改变（转录和代谢水平）仍是未解的课题。
海带（Saccharina japonica）是一种重要的世界性经济海藻，但海带育苗和养殖过程中病害频频爆发，严重时可导致海带减产20-50%。白化病是近年来海带育苗开始后一个半月至两个月时经常爆发的一种细菌性病害。其主要病症是在海带幼苗的尖端（远离生长点的组织）出现白化现象，如果得不到很好的控制，就会在发病部位发生绿烂，极大地影响健康海带种苗的供应和后续的养殖生产。现已证实，Pseudoalteromonas piscicida X-8（X-8）是海带白化病的致病菌。研究表明，X-8的侵染可引起海带表面附生细菌群落的失调，群落组成、多样性、指示物种和关键物种均发生显著的变化。然而，到目前为止，未见关于海带有益菌的相关报道。初步研究表明，X-2菌株（与X-8分离自同一株白化病藻体的菌株）对X-8具有较强的拮抗活性，抑菌圈直径为19 mm。那么，添加X-2是否可降低海带白化病的发生以及X-2降低X-8引起的海带白化病的分子机制尚不清楚。
结合侵染实验及多组学分析，本研究首先证实了溶藻弧菌X-2可有效地减少海带白化病的发生，并完成了其分类学鉴定；其次在（1）海带附生微生物群落、（2）海带自身转录水平及（3）海带共生体代谢水平三方面探究了有益菌X-2防控海带白化病发生的可能的分子机制。本研究不仅将为海藻有益菌、海藻附生微生物群落、经济养殖海藻宿主之间的相互作用机制提供新的见解，还将促进有益菌防控海带养殖过程中病害发生的应用。
- 结果 -
1. 海带有益菌的鉴定
Identification of a beneficial bacterium for S. japonica
X-2菌株与致病菌X-8分离自同一株白化病海带藻体。抑菌实验表明，X-2可显著地抑制致病菌X-8的生长，抑菌圈直径为19 mm（图1A）。负染透射电镜观察显示，菌株X-2呈杆状，具有单极鞭毛（图1B）。16S rRNA基因全长序列比对与系统发生树显示（图1C），X-2与标准菌株溶藻弧菌NBRC 15630T同源性为99.66%。此外，X-2与溶藻弧菌NBRC 15630T全基因组序列的平均遗传相似度（Average nucleotide identity，ANI）为 98.35%，因此，将X-2命名为溶藻弧菌X-2。
运用侵染实验，证实菌株X-2可降低由致病菌X-8引起的海带白化病的发病率。结果表明，侵染5小时，致病菌X-8单独侵染组出现白化的症状，且16小时内白化病海带藻体的比例持续增加（图1D）。相比之下，单独接种X-2菌株，未出现白化病症（P > 0.05，图 1D）。然而，与X-8单独侵染组相比，X-2和X-8（X-2:X-8 = 1:10）共侵染组可显著降低白化病海带藻体的比例（P < 0.001）（图1D）。显微观察也证实接种X-2无白化病症（图1E-H）。因此，X-2可降低由致病菌X-8引起的海带白化病的发生。
图1 有益菌菌株X-2的分类学鉴定
（A）X-2对致病菌X-8的拮抗活性，抑菌圈大小为19 mm；
（B）负染透射电镜的X-2形态学观察；
（C）基于菌株16S rRNA基因序列构建的系统发育树，杀鱼假交替单胞菌X-8为外群，括号内各菌株的登录号。各分支节点上展示出自展值（基于1000次重复）；
（D）白化病海带藻体的比例。使用不同小写字母表示各处理组间的统计学差异（P < 0.05）；
（E-H）侵染16小时，对照组、X-2侵染组、X-2与X-8共侵染组及X-8侵染组海带幼孢子体组织的显微观察图片。Bar：A, 10 mm；B, 1 μm；E、F、G、H，50 μm。
2. 接种X-2可引起海带附生细菌群落的改变
Co-culture with the beneficial bacterium X-2 results in changes in the epibacterial community of S. japonica
为评估有益菌对海带附生细菌群落的影响，运用16S rRNA基因高通量测序技术，分析了对照组、X-2单独侵染组、X-2与X-8共侵染组及X-8单独侵染组海带的附生细菌群落。通过比对接种菌株（X-2与X-8）的16S rRNA基因序列与每个样本中ASV的序列，确认了ASV000007和ASV000001分别是X-2和X-8。为避免接种菌株自身的影响，去除ASV000007 和 ASV000001后进行后续的细菌群落分析。结果表明，接种X-2对群落丰富度没有显著影响，但与其它三个处理组相比，X-2单独侵染组海带的附生细菌群落多样性显著降低（P < 0.001，图 2A）。此外，置换多因素方差分析（Permutation Multivariate Analysis of Variance, PERMANOVA）显示不同处理组的附生细菌群落结构显著不同（P = 0.001，图2B）。置换多因素离散度分析（Permutational Analysis of Multivariate Dispersions，PERMDISP）显示，与对照组或X-2侵染组相比，X-8单独侵染组的附生细菌群落结构离散度较高（P = 0.001，图2C），表明X-2可维持海带附生细菌群落的稳定性。
门水平上，四个处理组中，假单胞菌门（Pseudomonadota）和拟杆菌门（Bacteroidota）均是丰度最高的门。但不同处理组属水平之间存在显著差异。例如，对照组中相对丰度最高的属包括冷单胞菌属（Psychromonas, 16.3%）和假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas, 10.7%）。弧菌属（Vibrio, 49.9%）和假交替单胞菌属（18.2%）是X-2单独侵染组中丰度最高的属；弧菌属（28.1%）和假交替单胞菌属（29.7%）是X-2 + X-8共侵染组中丰度最高的属；而冷单胞菌属（16.8%）和假交替单胞菌属（15.6%）是X-8单独侵染组中丰度最高的属（图2D）。此外，指示物种分析显示，12个相对丰度大于 1.0%的属为各处理组的指示物种（图2E），其中弧菌属为X-2侵染组的指示物种，Mesorhizobium、Bradyrhizobium及Rubrobacter为X-8单独侵染组的指示物种（图2E）。因此，接种有益菌X-2可引起海带附生细菌群落的改变，增强群落结构稳定性，这可能有助于降低海带白化病的发生。
图2 X-2单独侵染、X-2 + X-8共同侵染和X-8单独侵染16小时海带附生细菌群落的变化
（A）对照组、X-2单独侵染、X-2 + X-8共同侵染和X-8单独侵染16小时海带附生细菌群落α多样性（香农指数）；
（B）各处理组海带附生细菌群落结构的NMDS图；
（C）基于PERMDISP方法对各处理组间海带附生细菌群落结构的离散度分析；
（D）门、属水平上，各处理组海带附生细菌群落的组成；
（E）各处理组相对丰度大于1.0%、且IndVal显著差异的属，IS1-IS3分别代表X-2单独侵染、X-2 + X-8共侵染、对照及X-8单独处理组中IndVal显著较高的属（P < 0.05）。
3. 有益菌X-2引发海带转录水平的改变
Beneficial bacterium X-2 elicits changes in the transcriptome of S. japonica
运用转录组学测序技术，分析了接种4小时（出现白化症状前）和5小时（开始出现白化症状）对照组、X-2单独侵染组、X-2 + X-8共侵染组和X-8单独侵染组海带的转录响应。主成分分析（PCA）和PERMAOVA分析表明，不同处理组间海带转录水平显著不同（P = 0.001），且不同时间差异显著（P = 0.001，图3A）。
侵染4小时，X-8单独侵染组 vs 对照组比较组，共检测到3,087个差异表达基因。其中，1,723个基因上调表达，1,364个基因下调表达（P < 0.05，差异倍数大于2或小于0.5，图3B）。X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组，共检测到84个差异表达基因。其中，32个基因上调表达，52个基因下调表达（图3C）。与侵染4小时相比，侵染5小时，X-8单独侵染组 vs 对照组（共1,936个差异表达基因，其中946个基因上调表达，990个基因下调表达，图3D）及X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组（共57个差异表达基因，其中37个基因上调表达，20个基因下调表达，图3E）两个比较组中均检测到较少的差异表达基因。
为确定有益菌如何影响海带对致病菌的转录响应，我们主要关注了X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组两个比较组共有的差异表达基因。侵染4小时，共检测到44个共有差异表达基因，其中22个基因可被注释（图3F和H）。包括多个参与细胞壁合成相关基因MEP21（编码甘露糖醛酸C-5差向异构酶）。大多数MEP21基因在X-8单独侵染组 vs 对照组显著下调，而在X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组显著上调。此外，两个编码与免疫应答和细胞内信号传导相关的富含亮氨酸的重复碳水化合物结合蛋白（LRR）的基因在两个比较组中均上调表达。然而，与对照组相比，X-8单独侵染组中与光合作用、氧化应激反应相关的基因和两个编码含锚蛋白重复序列蛋白（AKR）的基因表达显著上调，而X-2 + X-8共侵染组与X-8单独侵染组相比显著下调。侵染5小时，X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组两个比较组共有16个共有差异表达基因，其中4个基因可被注释（图3G和H）。与侵染4小时相似，两比较组中与免疫应答和细胞内信号传导相关的基因也显著上调。但与侵染4小时相比，侵染5小时两比较组均检测到较少的差异表达基因，暗示着有益菌X-2主要在白化病发生前起保护作用。综上，有益菌X-2可引发海带转录水平的改变，上调海带免疫和胁迫保护相关基因、下调光合能量合成相关基因。
图3 侵染4小时与5小时，X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组的差异表达基因
（A）侵染4小时与5小时，对照组、X-8单独侵染组、X-2 + X-8共侵染组海带转录组的主成分分析图；
（B）侵染4小时，X-8单独侵染组 vs 对照组比较组差异表达基因的火山图。火山图中每个点代表一个基因，红色点代表X-8单独侵染组中上调表达的基因，蓝色点代表下调表达的基因，黑色点代表无显著变化的基因；
（C）侵染4小时，X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组比较组差异表达基因的火山图；
（D）侵染5小时，X-8单独侵染组 vs 对照组比较组差异表达基因的火山图；
（E）侵染5 小时，X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组比较组差异表达基因的火山图；
（F）侵染4小时，X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组两比较组的韦恩图；
（G）侵染5小时，X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组两比较组的韦恩图；
（H）侵染4小时与5小时可被注释的差异表达基因，差异表达基因的名称及其参与的通路展示在右侧，MEP21：甘露糖醛酸C-5差向异构酶; LHC, 捕光天线复合体; MSR, 蛋氨酸亚砜还原酶; AKR, 含锚蛋白重复序列蛋白; G6PC1, 岩藻糖基转移酶。
4. 有益菌X-2引发海带共生体代谢水平的改变
Beneficial bacterium X-2 elicits changes in the metabolome of S. japonica holobiont
运用超高效液相色谱和高分辨率质谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS），探究了侵染4小时和5小时，对照组、X-8单独侵染组及X-2 + X-8共侵染组海带共生体代谢物水平的变化。偏最小二乘判别分析（Partial least squares Discriminant Analysis, PLS-DA）显示，对照组、X-8单独侵染组及X-2 + X-8共侵染组分开聚类，表明不同处理组代谢物水平显著不同（图4A和B）。
侵染4小时，X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组分别检测到43个和21个差异代谢物（P < 0.05，差异倍数大于1.5或小于0.667，VIP> 1.0，图4C和D）。相似地，侵染5小时，X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组分别检测到63个和25个差异代谢物（图4F和G）。
与转录组分析相同，我们主要关注X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组两个比较组共有的差异代谢物，以确定有益菌如何影响海带共生体对致病菌的代谢响应。侵染4小时，共检测到3个共有差异代谢物（图4E）。其中，甜菜碱在X-2 + X-8共侵染组中含量较高（图4I）。甜菜碱可以作为海藻的渗透压保护剂，它的增加可能有助于增强海带对致病菌的防御能力。侵染5小时，检测到6个共有差异代谢物（图4H）。值得注意的是，与侵染4小时相反，X-2 + X-8共侵染组的代谢物，如甜菜碱的丰度显著低于X-8单独侵染组（图4I）。这进一步表明有益菌X-2主要在白化病发生前起保护作用。
为阐明海带共生体代谢变化、海带附生细菌群落与海带自身转录变化之间的关系，利用Spearman相关分析对相对丰度排名前20位的ASV、差异表达基因及差异代谢物进行了相关分析，结果表明，侵染4小时及5小时大多数的差异表达基因、差异代谢物与弧菌属显著相关。值得注意的是，弧菌属是X-2侵染组的指示物种。因此，海带附生细菌群落在海带共生体中扮演重要的角色，通过操纵海带附生细菌群落能够激发海带共生体的整体反应以减轻病害的发生。
图4 侵染4小时与5小时，X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组的差异代谢物
（A）侵染4小时与5小时，对照组与X-8单独侵染组海带共生体代谢组的偏最小二乘判别（PLS-DA）分析图；
（B）侵染4小时与5小时，X-8单独侵染组与X-2 + X-8共侵染组海带共生体代谢组的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）图；
（C）侵染4小时，X-8单独侵染组 vs 对照组差异代谢物的火山图。火山图中每个点代表一个代谢物，红色点代表X-8单独侵染组中上调的代谢物，蓝色点代表下调的代谢物，黑色点代表无显著变化的代谢物；
（D）侵染4小时，X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组比较组差异表达基因的火山图；
（E）侵染4小时，X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组两比较组的韦恩图；
（F）侵染5小时，X-8单独侵染组 vs 对照组比较组差异表达基因的火山图；
（G）侵染5 小时，X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组比较组差异表达基因的火山图；
（H）侵染5小时，X-8单独侵染组 vs 对照组与X-2 + X-8共侵染组 vs X-8单独侵染组两比较组的韦恩图；
（I）侵染4小时与5小时可被注释的差异代谢物，差异表达基因的名称展示在右侧。
- 结论 -
通过添加有益菌X-2操纵微生物群落，可增强海带附生细菌群落的稳定性以及海带自身转录（上调海带与免疫和胁迫保护相关的基因、下调与光合能量合成相关的基因）及代谢水平（增加甜菜碱的丰度）的改变（图5）。这有助于增强海带的防御能力，降低由致病菌引起的白化病的发病率。此外，我们的研究结果表明，病害发生前应用有益菌可能是控制病害发生的关键。本研究证实了通过有益菌操纵微生物群落降低海藻病害发生的可行性，并阐明了有益菌X-2防控海带白化病发生的可能的分子机制。未来应着眼于有益菌X-2在海带养殖过程中防控病害发生的应用。
图5 X-2 + X-8共侵染组与X-8单独侵染组相比海带自身转录响应示意图
椭圆形代表差异表达基因编码蛋白。矩形代表差异代谢物。红色代表上调基因和代谢物，蓝色代表下调基因和代谢物。
参考文献
Ma M, Zhuang Y, Chang L, Xiao L, Lin Q, Qiu Q, Chen D, Egan S, Wang G. Naturally occurring beneficial bacteria Vibrio alginolyticus X-2 protects seaweed from bleaching disease. mBio. 2023. 14(4):e0006523. doi: 10.1128/mbio.00065-23
- 作者简介 -
第一作者
中国海洋大学
马铭宇
博士研究生
主要研究方向：有益菌防控海藻病害发生的分子机制。
通讯作者
新南威尔士大学
Suhelen Egan
副教授
Suhelen Egan教授长期从事藻-菌共生机制、藻类致病菌及其致病机理、海藻有益菌等方面的研究。取得的成果得到同行广泛认可，至今已在国际主流刊物Trends in Biotechnology、The ISME Journal、Environmental Microbiology等发表论文89篇，H指数38，引用次数超过6600次， 担任Frontiers in Microbiology主编。
中国海洋大学
王高歌
教授，博士生导师
王高歌教授于2001年获得中国海洋大学博士学位，2004年开始到中国海洋大学海洋生命学院工作，期间，2008-2009年于美国杜克大学（Duke University）作访问学者，长期从事海带致病菌/致病因子及其致病机理、有益菌防控海带白化病发生分子机制相关工作。目前在mBio、Aquaculture、Marine Life Science & Technology等主流期刊发表论文50余篇。担任德国水生生物学术期刊Fundamental and Applied Limnology副主编。
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