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写在前面
之前发布的《扩增子图表解读》系列，相信关注过我的朋友大部分都看过了(链接直达7月文章目录)。这些内容的最初是写本实验室的学生们学习的材料，加速大家对同行文章的解读能力。
《扩增子分析解读》系列文章介绍
扩增子分析是目前宏基因组研究中最常用的技术，由于微生物组受环境影响大，实验间重复较差，更需要更多的实验重复和分析技术来保证结果的准确性、可重复性。
本系统文章叫分析解读，即有详细的扩增子分析流程代码，又有本人对使用参数、备选参数意义的解读，可以让大部分零基础的人，更好的理解数据分析过程，并可亲自实践在自己的课题上，获得更好、更合理的实验结果。
本文采用目前最主流的扩增子测序数据类型HiSeq2500 PE250类型数据为例，结合目前主流方法QIIME+USearch优点组合定制的分析流程。本课程中所需的测序数据、实验设计和课程分析生成的中间文件，均可以直去百度云下载。链接：http://pan.baidu.com/s/1hs1PXcw 密码：y33d。
本课程代码的运行，至少需要Linux平台+安装QIIME1.9.1，我之前发布过三种安装QIIME的方法详见文章目录，总有一款适合你。
第三节. 去冗余,聚类,生成OTU表
本节课程，需要完成扩增子分析解读1质控,实验设计,双端序列合并和2提取barcode,质控及样品拆分,切除扩增引物
先看一下扩增子分析的整体流程，从下向上逐层分析。
分析前准备
# 进入工作目录
cd example_PE250上一节回顾：我们提取barcode,质控及样品拆分,切除扩增引物，经历了两节课6步数据处理才拿到我们扩增的高质量目的片段(貌似基因组/RNA-Seq测序结果直接就是这个阶段了，可以直接mapping)。
接下来我们将这些序列去冗余、聚类为OTU、再去除嵌合体，这样就可以获得高质量的OTU(类似于参考基因组/转录组)，用于定量分析每个OTU的丰度。这一阶段我们使用著名的扩增子分析流程Usearch。
Usearch简介
http://drive5.com/usearch/
Usearch于2010年发表在Bioinformatics，截止17年8月9日引用5190次；原来只是一个小小的高速序列聚类和比对软件，目前被作者开发成了扩增子分析流程，其中包括的关于序列聚类的算法UPARSE由作者单枪匹马发表在Nature method上，被引1529次；其实QIIME和Mother的聚类和比对都整合了此软件，核心算法是目前的主流，推荐使用。
优点：作者一直在更新，最新版10.0.240；体积小巧；安装方便，依赖关系极少(安装过QIIME的应该都想哭);
缺点：64位版收费(这么好的软件，收费也值得买)；部分功能还需使用QIIME脚本，估计将来可以全自己搞定，因为作者太强大。
软件作者不仅有Usearch一款软件，它的Muscle(多序列比对，引用18659+4212次), Uparse(OT聚类算法，引用1529次), Uchime(扩增子嵌合体检测，引用3558次)等众多流行工具，个人引用超4万次，而且发的软件大多由作者一人完成，佩服。
Usearch安装
这个软件64位版收费，但32位对任何人免费，可以在下面网址下载 http://www.drive5.com/usearch/download.html 同意许可协议，选择软件版本(5.2 – 10.0)，选择运行平台(Linux, Windows或Mac OSX)填写邮箱获得下载地址。不允许私人传播。
这里我选择10.0版本，系统选择Linux。
收到的邮件中第一个链接即下载地址，后面两个链接为帮助文档和安装说明，先不用管，按我下面的操作来。
# 下载的程序并重命名：下载链接来自邮件，请用户自行复制邮件中地址替换下面代码中的网址；或者在windows里面下载并重命名为usearch10
wget -O "usearch10" http://drive5.com/cgi-bin/upload3.py?license=XXXXXX
# 添加可执行权限
chmod +x usearch10
# 运行程序测试，成功可显示程序版本、系统信息和用户授权信息
./usearch107. 格式转换
做生信为什么要学Python/Perl/Shell这些语言，主要原因是各软件间要求的具体格式不同，需要进行格式转换，才能继续运行。因此想成为高手，不会语言基本寸步难行。
我们现在将QIIME拆分的结果类型，要转换成Usearch要求的格式。常见的解决思路是读Usearch帮助看它的格式要求，写个Python/Perl脚本转换格式。我这里使用了Shell脚本一行解决，优点是快，但缺点很多(人不容易看懂、不同Linux系统shell版本不同可能失效)。
我们要转换的序列文件其实一直是fasta格式，只是序列名称行格式不同
# 目前格式
>KO1_0 HISEQ:419:H55JGBCXY:1:1101:1931:2086 1:N:0:CACGAT orig_bc=TAGCTT new_bc=TAGCTT bc_diffs=0
# Usearch要求的格式
>KO1_0;barcodelabel=KO1; # 格式转换
sed 's/ .*/;/g;s/>.*/&&/g;s/;>/;barcodelabel=/g;s/_[0-9]*;$/;/g' temp/PE250_P5.fa > temp/seqs_usearch.fa上面这条命令有点复杂。sed是linux的一条命令，又是一种语言，擅长文本替换。替换的思路分四步：首先s/ ./;/g将原文件空格后面的内容(全是无用信息)替换为分号；其次s/>./&&/g是将序列名重复一次；再次s/;>/;barcodelabel=/g将重复后的;>替换为;barcodelabel=；最后s/_[0-9]*;$/;/g替换序列编号为分号。这只是我的思路，分析数据如解答数学题，可以有多种解法，你够聪明还会想出更好的解法。
新人一定感觉这命令每句都不像人话，我告诉你Perl和Shell就是这样–难读但高效。改用易读的Python语言，肯定没有Shell简洁。
8. 去冗余
为什么要去冗余？
因为原始序列几百万条，聚类计算的时间极其恐怖。而已知扩增子测序结果中序列重复度高，并且大量出现1次或几次的序列统计学和功能上意义不大。因此将几百万条序列去冗余，并过滤低丰度序列，一般只剩几万条，极大的减少了下游分析的工作量，并可使结果更容易理解。
usearch10的去冗余命令叫-fastx_uniques，紧跟着输入文件；
-fastaout接输出文件；
-minuniquesize参数设置保留的最小丰度reads数，建议最小设置为2，去掉所有的单次出现序列(singletons)，数据量大建议设置总数据量的百万分之一并取整数部分
-sizeout 在序列名称中添加序列出现的频率
# 序列去冗余
./usearch10 -fastx_uniques temp/seqs_usearch.fa -fastaout temp/seqs_unique.fa -minuniquesize 2 -sizeout计算过程中出现如下信息：
00:06 607Mb 100.0% Reading temp/seqs_usearch.fa
00:06 574Mb CPU has 96 cores, defaulting to 10 threads
00:08 915Mb 100.0% DF
00:09 935Mb 1268345 seqs, 686530 uniques, 624363 singletons (90.9%)
00:09 935Mb Min size 1, median 1, max 18774, avg 1.85
62167 uniques written, 182874 clusters size < 2 discarded (26.6%)主要内容为读取输入文件；
检查到系统有96个CPU，默认使用了10个线程；
总共有1268345条序列，其中非重复的序列有686530个，非重复且只出现一次的有624363个(90.9%的非冗余序列是singletons，多吗？)；
最小值、中位数、最大值、平均值；输出结果有62167个结果，丢弃掉的数据占26.6%。
本条命令的详细使用，请阅读官方文档 http://www.drive5.com/usearch/manual/cmd_fastx_uniques.html
9. 聚类OTU
为什么要聚类OTU？
是因为Unique的序列仍然远多于物种数量，并且扩增的物种可能存在rDNA的多拷贝且存在变异而得到来自同一物种的多条序列扩增结果。目前人为定义序列相似度通常97%以上为OTU，大约是物种分类学种的水平，实际上1个OTU可能包括多个物种，而一个物种也可能扩增出多个OTU。
下面我们用usearch10将非冗余的序列聚类，
参数-cluster_otus接输入文件；
-otus后面为输出的otu文件的fasta格式；
-uparseout输出聚类的具体细节
-relabel Otu为重命名序列以Otu起始
# 聚类OTU
./usearch10 -cluster_otus temp/seqs_unique.fa -otus temp/otus.fa -uparseout temp/uparse.txt -relabel Otu程序运行过程会显示运行时间、进度，发现的OTU，以及嵌合体数据；结果如下：
03:39 84Mb 100.0% 5486 OTUs, 9187 chimeras程序一共运行了3分39秒，聚类发现5486个OTUs，同时发现了9187个嵌合体并已被丢弃。
Usearch聚类算法之所以能发表在Nature Method上，就是因为其算法UParse在非常强的嵌合体检测能力，对人工重组数据评估，更接近真实结果。下一节我们将详细讲嵌合体产生的原因，以及去除的原理。
本条命令的详细使用，请阅读官方文档 http://www.drive5.com/usearch/manual/cmd_cluster_otus.html
小技巧：统计fasta文件中序列的数量
fasta文件每条序列以大于号(>)开始，其数量与序列数量相同，使用grep检索含有>的行，同时用-c参数对数量进行统计，即可快速获得fasta文件中序列数量。
# 查看OTU数量
grep '>' -c temp/otus.fa写在后面
今天先到这里，本文已经讲了三个程序的使用，够大家学习一会的了。要想了解这些程序的更多功能，一定要阅读程序的帮助全文，才能有更深入的理解。
下节预告：扩增子分析解读4去嵌合体,生成OTU表和代表性序列
Reference
- http://www.drive5.com/usearch
- http://www.drive5.com/usearch/manual/cmds_all.html
- http://www.drive5.com/usearch/manual/cmd_fastx_uniques.html
- http://www.drive5.com/usearch/manual/cmd_cluster_otus.html
- http://drive5.com/usearch/manual/chimera_formation.html
- http://www.cnblogs.com/xudongliang/p/6497465.html
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