使用STAR构建参考基因组并比对

最新推荐文章于 2023-08-21 10:08:21 发布
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版权

使用STAR构建参考基因组

之前我们使用了hisat2构建了参考基因组序列，现在主流的软件是hisat2和STAR
于是我又跟着潘师兄的教程，来走一遍转录组，这里使用的就是STAR
在这过程中我还是碰到了许多问题和要注意的点，来看一下吧

软件安装

还是老样子，使用conda安装SATR，但是我最开始不清楚conda能不能安装STAR，于是我先看一下conda里面有没有它

conda search star
Loading channels: done
# Name                       Version           Build  Channel
star                          2.4.0j               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.4.0j               1  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.4.2a               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.5.0a               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.5.0b               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.5.0c               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.5.1b               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.5.2a               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.5.2b               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.5.3a               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.5.4a               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.6.0b               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.6.0c               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.6.0c               1  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.6.0c               2  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.6.1a               1  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.6.1b               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.6.1d               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.7.0b               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.7.0d               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.7.0e               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.7.0f               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.7.1a               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.7.2a               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.7.2b               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.7.2c               0  anaconda/cloud/bioconda
star                          2.7.3a               0  anaconda/cloud/bioconda

我们就直接安装最新版本的就行了，下面我们用conda安装指定版本的STAR
用 = 指定version就i行了

conda install star=2.7.3a

构建参考基因组

数据准备

  1. 参考基因组序列
  2. 基因注释文件
    这些文件我们在转录组数据准备里面已经说过了，这里就不赘述。

开始构建

STAR --runThreadN  --runMode genomeGenerate \
--genomeDir \
--genomeFastaFiles \
--sjdbGTFfile \

–runThreadN 是指构建是使用的线程数，在没有其他数据在跑的情况下，可以满线程跑
–runMode genomeGenerate 让STAR执行基因组索引的生成工作
–genomeDir 构建好的参考基因组存放的位置，最好是单独建立的一个文件夹
–genomeFastaFiles 参考基因组序列文件
–sjdbGTFfile 基因注释文件

然后我们照着这个走一次

STAR --runThreadN 20 --runMode genomeGenerate \
--genomeDir /home/lyc/workspace4.21.20/data/ref \
--genomeFastaFiles /home/lyc/workspace4.21.20/data/ref/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
--sjdbGTFfile /home/lyc/workspace4.21.20/data/ref/Homo_sapiens.GRCh38.99.gtf \
#打开htop监控
htop
#发现才挂上去的脚本，一下就结束了
cat Log.txt
#打开日志文件，得到如下报错
step1.biud_index.sh: line 4: --sjdbGTFfile: command not found
Apr 23 11:24:00 ..... started STAR run
Apr 23 11:24:00 ... starting to generate Genome files

EXITING because of INPUT ERROR: could not open genomeFastaFile:

Apr 23 11:24:31 ...... FATAL ERROR, exiting

这就很奇怪了，我明明是按照帮助文档来的啊
后来我发现，是因为在语句
--genomeFastaFiles /home/lyc/workspace4.21.20/data/ref/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
后面多了一个空格，导致STAR能正常运行，所以敲代码的时候，一定要注意规范，这种小错误往往最致命且不容易被发现。
我在上面的脚本中已经删掉了这个空格，你可以直接复制粘贴使用了。

比对

我们来看一下比对的代码

STAR 
--runThreadN 20 \
--genomeDir /home/lyc/workspace4.21.20/data/ref \
--readFilesCommand gunzip -c \
--readFilesIn /home/lyc/workspace4.21.20/data/cleandata/N052611_Alb_1.fastq.gz /home/lyc/workspace4.21.20/data/cleandata/N052611_Alb_2.fastq.gz \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
--outFileNamePrefix N052611_Alb \

–runThreadN 运行的线程数，根据自己的服务器合理选择
–genomeDir 构建的参考基因组位置
–readFilesCommand 对于gz压缩的文件，我们可以在后面添加 gunzip -c
–readFilesIn 输入文件的位置，对于双末端测序文件，用空格分隔开就行了
–outSAMtype 默认输出的是sam文件，我们这里的BAM SortedByCoordinate是让他输出为ban文件，并排序
–outFileNamePrefix 表示的是输出文件的位置和前缀

然后就是输出文件的问题，输出的文件不止一个，包含了比对过程中的一些信息

  1. Aligned.out.sam或者Aligned.out.bam
    它指的就是我们的比对结果
  2. Log.progress.out
    它是每分钟记录一次的对比情况
  3. Log.out
    它记录了STAR程序在运行中的各种情况，当我们的结果出现异常时，我们可以查看具体的运行情况，来查找错误
  4. Log.final.out
    它包含的是对比完以后的对比统计信息
  5. SJ.out.tab
    它包含了剪切的信息
yssxswl
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