Plant Cell | DAP-seq和ATAC-seq助力构建玉米胚乳发育调控网络

禾本科植物，如水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）的胚乳，不仅是种子发芽和幼苗早期生长的能量来源，也是人类食物、畜禽饲料及工业用途的重要原料。胚乳的发展经历两个主要阶段：一是细胞发展阶段，此时细胞会经历大量的分裂与分化；二是籽粒灌浆阶段，细胞在此期间积累淀粉和蛋白质等储存物质。

三个关键转录因子，即NAKED ENDOSPERM1 (NKD1)、NKD2和OPAQUE2 (O2)，在玉米胚乳的细胞发展和储存物质积累中扮演了核心角色。这些转录因子的突变体在胚乳灌浆过程中展现出一系列相似的缺陷，这暗示它们或许存在某些相互关联的功能。但是，关于这三个转录因子如何共同调控下游基因，以及它们在胚乳发展中的整体调控景观，我们仍知之甚少。

2023年10月5日，The Plant Cell 在线发表了爱荷华州立大学Philip W Becraft团队题为 ”NAKED ENDOSPERM1, NAKED ENDOSPERM2, and OPAQUE2 interact to regulate gene networks in maize” 的文章，作者构建了一套纯合系，涵盖了nkd1、nkd2和o2的所有单一、双重和三重突变组合以及野生型。他们观察到合成表型，这表明这三个转录因子在胚乳发育中存在交互作用。研究发现，这三个转录因子在从细胞发育过渡到存储物质积累的阶段可能调控激素反应、细胞壁结构及其他细胞发育过程，并调控淀粉代谢、脂质储存及储存蛋白的累积。这些过程由一个动态且层次清晰的基因网络所指导，而这三个转录因子起到了中心调控的作用。此外，作者还揭示了NKD1和NKD2的潜在直接目标基因，以及它们在染色质上的可及性状态和与每种突变体相比的基因表达差异。

研究路线

• 研究技术：DAP-seq、ATAC-seq和RNA-seq(爱基百客均可提供）

研究结果

1.  灌浆过程中nkd1、nkd2和o2基因的相互作用

为了探究nkd1、nkd2和o2基因的组合效果，作者在W22近交系背景中制备了相应的纯合突变组合。o2突变体具有正常的谷粒大小但透明度降低，而nkd1和nkd2的双重突变体呈现较小、皱缩状的谷粒，并且透明度同样降低。而当nkd1、nkd2和o2三者都发生突变时，其谷粒则明显萎缩和皱化（图1A）。这些表型特征暗示，在谷物的发育过程中，nkd1、nkd2和o2三者之间存在相互作用。

作者利用光学和透射电子显微镜（TEM）对胚乳的细胞层面表型进行了深入研究，并在AL、SA和SE中观察到多种表型变异（见图1，B至D）。通过测量成熟的干谷粒中的总淀粉含量，作者发现与WT相比，o2、nkd1和nkd2的双重突变体以及nkd1和o2的双重突变体的淀粉含量显著减少，而三重突变体的淀粉含量仅为WT的30%，这一数值明显低于所有其他基因型（图1E）。HPLC zein分析显示，所有含有o2突变体的16 DAP胚乳中大部分α-zein同构体的显著减少（图1F）。这些数据进一步证明，nkd1和nkd2的突变增强了o2对储存蛋白积累的影响。

作者利用FACS（流式细胞分选）技术分选了不同倍性的玉米胚乳细胞核，以研究nkd1、nkd2和o2基因对细胞内倍性的影响。结果显示，与WT相比，o2突变体导致胚乳细胞的倍性水平增加，不论是nkd1单独突变，还是与nkd2、o2或二者都结合的突变体，均倾向于减少较低倍性的核（特别是6C），同时增加24C和48C核的比例（图1G）。这些数据提示，NKD1、NKD2和O2的功能可能是为了控制核内复制的过程。

图1：nkd1、nkd2、o2三突变体的缺陷表型。

2.  nkd1、nkd2 和 o2 基因在从细胞发育到营养积累的过渡中发挥作用

为了深入探索3个转录因子间的调控关系，作者对8种基因型在8、12和16 DAP的胚乳组织开展了转录组（8种基因型 x 3个时间点 x 4个生物学重复，共96个样本）分析。主成分分析（PCA）揭示，发育时间是产生主要变异的因素，而基因型则是次要因素（图2A）。

在差异基因（DEG）分析之后，作者对14,099个DEGs的进行了WGCNA分析，结果将12,458个基因归类为11个模块（M1-M11）。对每个模块进行GO富集分析，细胞壁发育和激素通路等被显著富集。通过分析各模块各基因型随时间的变化，作者发现大部分的突变型在大多数模块中的表现相似。然而，nkd1 nkd2 o2三重突变体是个例外，在随时间推进时，其在M2、M9、M10和M11模块中相对其他基因型有所上升（图2 C、J、K和L）。这些模块与细胞壁和表皮发育有关，暗示随着发育的进行，这三个转录因子可能共同作用限制细胞的发育。

图2：8到16 DPA不同基因型间的转录组学关系。

3.  NKD1、NKD2和O2在每个时间点共同调控不同组的共表达模块

作者首先通过所有时间点的差异表达基因（DEGs）创建了一个共表达网络，这是一个汇总时间点的WGCNA。在这种情况下，大多数模块在8 DAP的不同基因型之间没有显著差异（图2）。考虑到基因表达的动态性，作者假设随时间推移，共表达模式可能会改变。为了测试这个假设，作者使用每个DAP的DEGs分别进行了WGCNA分析，并在不同的时间点确定了各种共表达模块。具体来说，在8、12和16 DAP时，分别识别出了5、9和8个共表达模块，每个模块都与三个转录因子中的至少一个有关（图 3A）。8 DAP的某些模块在汇总时间点的WGCNA中并未被检测到，证实了共表达网络的动态性。此外，12和16 DAP的模块大体上与汇总时间点的模块相似，但也存在一些特定的模块，例如与压力反应相关的模块（图3B）。作者还对比了不同时间点的模块，发现它们在转录因子关联和GO富集方面存在相似性。模块基因随时间的变化，展现了从一个时间点到下一个时间点模块的分裂和汇合现象，反映了模块间的动态关系（图 3, C和D）。

图3：共表达模块在各个时间点与nkd1、2、o2相关，以及不同时间点模块之间的动态关系

4.  NKD1、2和O2相互作用调节基因网络

共表达网络分析揭示了NKD1、NKD2和O2可能共同调控基因网络，并发现双重或三重突变体的MEs与相应的单突变体存在不同的动态模式（图2）。此外，部分模块与三大关键转录因子之间存在多重相关性（图3A）。深入探讨这些转录因子在基因网络中的交互作用后，发现所有TF组合均有交互作用，并且这些交互作用影响的DEGs数量随时间变化（图4A）。特定交互作用如NKD1-NKD2在不同时间点上主导了不同功能的基因表达，表明其调控功能呈动态变化（图4B）。超几何检验进一步证实了转录因子之间在共表达模块的调控中的动态交互，显示了多个模块可能受到转录因子交互作用的影响（图4C），并且这些交互在不同模块中对基因表达产生了多种影响（图4D）。

图4：nkd1、nkd2和o2相互作用对deg和共表达网络的影响。

5.  NKD1、2和O2基因网络在胚乳组织类型中的功能

为了探索NKD1、NKD2和O2如何在特定的胚乳组织中调控基因表达，作者与早期研究进行了比较。作者发现，nkd1 nkd2的差异表达基因与除BETL外的每种细胞类型都有显著重叠，而o2的差异表达基因只与BETL和CSE相关（图5）。与此同时，M8-1和M8-3共表达模块包含了大量的AL基因，与脂质、激素和细胞壁功能相关，这些功能对AL尤为重要（图3B和图5）。此外，与淀粉代谢相关的M8-2模块与CSE基因有重叠。除AL外，各种基因相互作用还影响了其他所有组织中的基因表达。

图5：胚乳组织优先基因与DEGs、共表达模块或受8dap相互作用影响的基因的重叠。

6.  NKD1、2和O2通过hub TFs直接或间接调节共表达模块

作者利用DAP-seq技术对NKD1和NKD2蛋白在体外的结合模式进行了深入分析，确认了它们潜在的结合基序为TTTGTC，并鉴定出NKD1和NKD2在基因组中的结合位点（图6A, 图6B；补充数据集S9, S10）。对于NKD2，它在多个时间点都与特定基因型的DEGs显示出显著的重叠，而NKD1则因为peak数量较少，其重叠度较低（图6C）。进一步的功能富集分析揭示NKD1、2和O2可能直接调控的基因中，许多与转录因子活动有关，这些基因可能参与细胞壁的形成、生长素信号传导以及跨膜运输等过程。

为了深入理解这些因子在基因网络中的作用，作者针对一些关键模块进行了分析，鉴定出一些hub基因和它们可能的上游调控因子，并建构了一个与所选择模块相关的基因调控网络（图6D）。此外，作者还对一些关键模块中的转录因子进行了DAP-seq，并鉴定了它们可能的下游目标，揭示了这些转录因子在不同生物过程中可能发挥的功能（补充图S8A）。

图6：NKD1和NKD2的DAP-seq分析，以及基于WGCNA和DAP-seq的分层网络布局。

7. NKD1、NKD2和O2相互作用影响胚乳染色质的可及性

转录因子通过改变染色质的可及性来展现其作用。为了理解NKD1、NKD2和O2之间的相互作用如何影响胚乳的调控组学，作者对8种不同的基因型的胚乳进行了ATAC-seq。这些测序结果揭示了不同基因型间染色质可及性的区域，部分区域是位于远离基因的基因间区，一些则更靠近或在基因的启动子区域（补充图S9; 补充数据集S13-S20）。

主成分分析进一步证明了各个基因型在调控组学上的差异，特别指出了NKD1、NKD2和O2的相互作用对胚乳的影响（图7A）。NKD1和NKD2与染色质的相互作用方式也受到O2的影响，这一点通过比较不同基因型的染色质可及性峰得到证实（图7B）。

作者进一步探讨了哪些染色质区域可能直接受NKD1或NKD2的调控，并找到了与ATAC-seq差异峰重叠的DAP-seq数据，从而确认了可能的调控区域（图7C）。通过结合RNAseq和ATACseq数据，作者分析了染色质可及性如何影响NKD1或NKD2的潜在目标基因表达，尤其是与某些关键基因如o2、hb75、mybr24和arf1的相互作用（图7D，表2）。最后，通过对某些区域进行基序富集分析，作者揭示了在不同突变体背景下，哪些转录因子家族的结合基序可能与NKD2的结合相关（补充表S4）。

图7：16个DAP玉米胚乳的染色质可及性分析。

总  结

图8：NKD1、2和O2调控胚乳发育过渡过程的模型。