ChIP-seq/DAP-seq/ATAC-seq/CUT&Tag结果可视化-IGV使用攻略

  背景介绍  

你是不是经常在文献中看到下面这种图，好奇如何做的？在发表ChIP-seq/DAP-seq/ATAC-seq/CUT&Tag文章时，想在文章中放几张目标基因的可视化图？

项目文章 | Plant Physiology 华南农业大学揭示组蛋白修饰调节水稻器官大小的表观遗传机制

喜讯！ChIP-seq再立功，组蛋白去甲基化酶在水稻种子的表观调控机制见刊The Plant Journal

要做此图之前，我们首先得搞清楚两个问题：

1、这个图是干嘛用的？

2、怎么看？

答案是：此图是测序reads的可视化，利用reads和参考基因组比对之后的结果，用来展示目标基因上的转录因子结合/组蛋白修饰/染色质开放性的。

鉴定转录因子在基因组上结合常用的技术手段是ChIP-seq/DAP-seq，检测组蛋白修饰的全基因组分布用ChIP-seq/CUT&Tag，而对染色质可及性的检测则用ATAC-seq。ChIP-seq/DAP-seq/CUT&Tag的原理都可以归纳为目标蛋白在基因组某个位点结合后，含有该位点的DNA片段将会被选择性富集；测序之后，来自于此DNA片段的reads较其他非蛋白结合的DNA片段reads多，在数据可视化上呈现一个堆集起来的山峰（在计算机概念上叫“peak”）。ATAC-seq的原理则是利用Tn5转座酶特异性识别染色质开放区并酶切该区域，这样在测序之后，来自于染色质开放区的reads也会较非染色质开放区的reads多，形成peak。

IGV基础知识  

在掌握上面这些基础知识之后，就用来到今天的重点，怎么画这幅图？如果你有生信基础和环境，推荐你用R包Gviz。如果你没有生信基础，那就给你推荐今天的主角IGV。

IGV(Integrative Genomics Viewer)，一款便捷的交互式使用工具，用于基因组数据的可视化，支持Windows/MacOS/Linux多平台使用，同时支持FASTA/GFF/GTF/BAM/BED/TDF/bedGraph/BEDPE/bigBED/bigGenePred/bigNarrowPeak/bigWig……多种格式文件输入。一般，我们常用到的文件格式主要是FASTA/GFF/GTF/BAM/BED/TDF/bigWig。

◆  FASTA：或称.fasta或.fa文件，指定导入参考基因组的参考序列。FASTA文件中的序列名称是出现在IGV工具栏的染色体下拉列表中的染色体名称。IGV根据染色体的名称对它们进行排序，而不是它们在FASTA文件中的顺序。

◆  GFF/GTF：通用特征格式（GFF）文件是一个简单的制表符分隔的文本文件，用于描述基因组特征（基因结构：基因起始和终止位置，外显子、内含子所在位置以及基因的转录方向）。IGV支持GFF2、GFF3和GTF文件格式，GFF3是最常用的。

◆  BAM：BAM（.bam）文件是SAM文件的二进制版本，SAM文件（.sam）是一个包含序列比对数据的制表符分隔的文本文件，IGV也支持BAM格式。值得注意的有两点，一是BAM和SAM都得按位置排序并索引，排序和索引可以用igvtools完成；二是参考基因组和SAM/BAM的染色体名称必须一致（很多人很容易忽视这点，导致文件导入后没有图像，只是一条线）。

◆  BED：BED（.bed）是一个用于定义特征（可以是基因、SNP位点、甲基化位点、peak）轨迹以制表符分隔的文本文件，它可以有任意文件扩展名，但建议是.bed。

◆  TDF：TDF（.tdf）是一个二进制文件，用窗口的方式来记录测序深度信息。相比BAM文件，TDF文件会小很多，导入和查看也更快速。可以通过igvtools来生成TDF文件。下图清晰表明了两者的区别，在较小的分辨率下，bamcoverage基本和tdf无异；但当分辨率较大的时候，可以看出bam是以单碱基存储深度的，而tdf是以区域内储存平均深度的。

◆  bigWig：和TDF类似，只是统计区间相较于TDF更大。类似的文件还有bedGraph，统计区域比TDF还小。下图展示了三种文件的区别，在小分辨率下几乎没差异，在大分辨率下就会看出细节差异。因此，在文件大小上，bedGraph > TDF > bigwig。一般以bigWig（.bw）上传到数据库。

  IGV的使用  

第一步：IGV安装

上IGV官网，下载对应电脑系统的程序，按照提示安装即可。下载链接：https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/

第二步：IGV使用

首先，导入基因组。从IGV导航栏里的Genomes >> Load Genome from File进入；

接着，导入注释文件。从导航栏里的File >> Load from File进入；

当然，你也可以选择创建一个genome文件，将序列文件和注释文件合一，下次就不用再分别导入两个文件了。创建方法为：从导航栏里的Genomes >> Create. Genome File进入，然后在对话框里依次输入待创建基因组的命名，导入序列文件和注释文件，最后点击确认，设置好存储位置即可。

接下来是重点，导入待看的track文件（TDF/bigwig/bedgraph）。单击鼠标左键选择track（ctrl+单机左键可同时选择多个track），然后单击鼠标右键调出设置栏，调整track高度和data的范围，使峰型图在视野里看起来更合适。Tips：每个基因上的强度存在差异，因此data的range要根据目标基因设定，可以多次设定。图形没完全显示，就把值调大点；图形太矮，就把值调小一点。总之一点，怎么好看怎么来，调到自己满意即可。

随后，定位到目标基因。下面以本文第一幅图的OsCKX1（Os01g0187600：chr01:4,695,238-4,701,036）为例展示。主要有两种方法：1）大概定位法：根据基因的大概位置，下拉染色体框，选择对应的染色体，然后缩小区间。比如OsCKX1在chr1上的大概4.7M的位置，先用定位框选择5Mb左右的一个大框，然后再在4.7Mb再次精细框选。2）直接输入法：在输入框里面输入基因（注意基因名和基因ID的区分）或者基因的精确染色体定位，点击Go就可以直接跳转到目标基因了。

以上两种方法都可以定位到目标基因，随后就是图像美化，我们按照发表文章里的色泽。将WT的track改成粉色，Ossdg711的track改成绿色。和调整track的高度和数据值一样，先调出设置栏，点击Change track Color，选择想要的颜色。Tips：不同track设置不同颜色时，要一个一个track调整。

调整好了图像之后，从File >> Save Image保存图像，以矢量图.svg格式存储，方便后面用AI编辑。

  后  记  

如果您觉得自己一个一个基因编辑美化太麻烦，爱基百客生物可以提供ChIP-seq/DAP-seq/ATAC-seq/CUT&Tag等全套技术服务，提供可视化文件供您检索基因。此外，我们的生信团队还能提供您挑选后的指定基因的可视化绘图服务。欢迎与我们联系。