利用cellranger对（人）单细胞数据进行上游分析(实验室日记day1和day2)

一、Cellranger以及参考基因组的下载（linux）

        截至目前10×Genomics的官网显示Cellranger的最新版为“Cell Ranger (tar.gz compression) - 7.2.0” ，我们首先在Xshell执行下列代码之一下载Linux 64-bit的安装包：

10x官网有教程，可以一步步来，但是我后面下载了miniconda，activate了一个Cellranger环境，方便我后面使用，以上blog不展示此内容，也可以mkdir一个cellapps文件夹下（新手建议）。

安装miniconda：

wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

参考链接：

Linux下conda安装及使用 - 简书 (jianshu.com)

Day3-单细胞数据fastq及cellranger - 简书 (jianshu.com)

遇到错误：例如直接在官网复制这段代码下载6.1.2版本，就会显示下载成功，但一直解压不成功等错误

错误显示：

yulab1@nuca:~/XiaoDi/cellapps$ tar -zxvf cellranger-6.1.2.tar.gz

gzip: stdin: not in gzip format

tar: Child returned status 1

tar: Error is not recoverable: exiting now

解决方法：下载命令的某些部分会定期更改，因此复制官网上面的确切命令可能不起作用。确保从Download page界面复制整个命令：

https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/downloads#download-links

遇到错误：明明已经保存了环境，每次打开cellranger总是找不到命令：（环境总是添加不上，师姐也失败，可能是没有权限）

错误显示：command not found

解决方案：

export PATH=/home/yulab1/XiaoDi/apps/cellranger-7.2.0:$PATH

每次登都临时开一个cellranger的环境

添加路径(shell中输入)——添加失败：

pwd
echo 'export PATH=/home/yulab1/XiaoDi/apps/cellranger-7.2.0:$PATH ~/.bashrc
source ~/.bashr

二、按照官网的程序，在xshell中测试是否安装成功，显示以下则安装成功：

三、对人的参考基因组和注释进行下载和解压（ensembl官网）

注意人和小鼠不使用toplevel的序列文件：（错误）

curl -O https://ftp.ensembl.org/pub/release-110/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa.gz

使用此参考基因组：（正确）

curl -O https://ftp.ensembl.org/pub/release-110/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna_sm.primary_assembly.fa.gz

原因：需要注意的是，大部分物种我们需要下载toplevel的序列文件，但是对于人和小鼠这类有单倍型信息的基因组，我们需要下载primary_assembly的序列。将下载好的文件传到linux主机上。

错误显示：Curl使用错误，好像是代理ip问题，我先使用了wget这个命令下载

下载注释：

curl -O https://ftp.ensembl.org/pub/release-110/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.110.chr.gtf.gz

解压文件：gzip -d Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa.gz（因为不是tar.gz后缀文件所以不能使用tar命令）

四、过滤注释文件

方法一：

cellranger mkgtf Homo_sapiens.GRCh38.110.chr.gtf Homo_sapiens.GRCh38.110.chr.filtered.gtf --attribute=gene_biotype:protein_coding

（运行后也会出现过滤文件，但是进行下一步生成参考基因文件夹就会失败）

方法二：使用以下代码（成功）

cellranger mkgtf \
Homo_sapiens.GRCh38.110.chr.gtf \
Homo_sapiens.GRCh38.110.chr.filtered.gtf \
                 --attribute=gene_biotype:protein_coding \
                 --attribute=gene_biotype:lincRNA \
                 --attribute=gene_biotype:antisense \
                 --attribute=gene_biotype:miRNA \
                 --attribute=gene_biotype:IG_LV_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_V_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_V_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_D_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_J_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_J_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_C_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_C_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_V_gene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_V_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_D_gene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_J_gene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_J_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_C_gene \

五、生成参考基因组文件夹，在服务器中需要1-2h，用nohup命令挂起(发现错误)

在Xshell输入：

nohup cellranger mkref --genome=Homo_sapiens --fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa --tered.gtf &

错误显示：

nohup报错 nohup: ignoring input and appending output to ‘nohup.out’

参考链接：

nohup报错 nohup: ignoring input and appending output to ‘nohup.out’_centos_我吃西红柿11-华为云开发者联盟

改正代码:

nohup cellranger mkref --genome=Homo_sapiens --fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa --tered.gtf > /dev/null 2> /dev/null &

错误显示：以上流程跑出来会说缺少文件

六、不挂nohup命令生成参考基因组

尝试一（错误）：

cellranger mkref \

--genome=Homo_sapiens \

--fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa \

--genes=Homo_sapiens.GRCh38.110.chr.filtered.gtf && \

--ref-version=3.0.0

错误显示：运行成功了，但是又缺少文件，我也不知道为什么

尝试二（失败）：

cellranger mkref --genome=Homo_sapiens.GRCh38.110 \
--fasta= Homo_sapiens.GRCh38.dna_sm.primary_assembly.fa \
--genes= Homo_sapiens.GRCh38.110.chr.filtered.gtf

错误显示1：表示 '--genome'<GENOME_NAMES>：只能包含字母、数字、下划线和破折号。

错误显示2：因为等号后面多了空格，导致输入失败

尝试三：（成功）正确代码（跑一个1h左右）

cellranger mkref --genome=Homo_sapiens \
--fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna_sm.primary_assembly.fa \
--genes=Homo_sapiens.GRCh38.110.chr.filtered.gtf 

六、cellranger count比对和计数分析

Sample Name命名是CO-EA（但是一般横杠会识别不了，建议改成下划线CO_EA）

改正以后如下：

注意新版本的内含子的默认选项（减少测序浪费）:

cellranger count分析代码

（1）不含内含子（默认true）:

cellranger count --id=nointrons_CO_EA_run_cellranger_count \

   --fastqs=/home/yulab1/XiaoDi/run_cellranger_count/CO_EA_fastqs \

   --sample=CO_EA \

   --transcriptome=/home/yulab1/XiaoDi/miniconda/Homo_sapiens \

   --include-introns=false 

（2）默认含内含子的代码：

cellranger count --id=CO_ET_A_run_cellranger_count \

   --fastqs=/home/yulab1/XiaoDi/run_cellranger_count/CO_ET_A_fastqs \

   --sample=CO_ET_A \

   --transcriptome=/home/yulab1/XiaoDi/miniconda/Homo_sapiens

参考设置：

--id：设置输出文件夹路径名称

--fastqs：设置包含目标FASTQ文件的文件夹路径

--sample：如果包含多个样本，指定要分析的样本名 （非必须）

--transcriptome：设置参考基因组文件路径

linux基本操作：

创建文件夹：

mkdir CO_ET_AC_fastqs

复制文件夹：

cp -r /home/yulab1/XiaoDi/co_culture_sc/Cleandata/CO-ET-A/CO-ET-A_S1_L001_R2_001.fastq.gz /home/yulab1/XiaoDi/run_cellranger_count/CO-ET-A/

修改文件名称：

mv CO-ET-A CO_ET_A_fastqs

七、cell ranger结果详细解读

关于web_summary.html

Estimated number of cells - 样本测到的细胞数

Mean reads per cell - 每个细胞测到的平均reads

Median genes per cell - 每个细胞基因数的中位数

Sequencing中：

Number of reads - 测到的总read数目

Valid barcodes - UMI校正后匹配的UMI数量

Sequencing saturation：测序饱和度，一般60-80%比较合适（阈值范围可以适当调整，但是高于70%/80%左右绝对OK）

如果测到的细胞数多，但是每个细胞里面的平均reads数少，那么饱和度就不高，反之，饱和度高。但也不是越高越好，背后原理是抽样的原理，到达80%左右就可以代表整个样本。