TCGA 数据分析实战 —— GSVA、ssGSEA 和单基因富集分析

最新推荐文章于 2024-08-27 00:32:37 发布
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分类专栏： R 数据分析实战 生信数据库 文章标签： 数据分析 算法 机器学习
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TCGA 数据分析实战 —— GSVA、ssGSEA 和单基因富集分析

文章目录

前言

前面，我们介绍过了差异基因的功能富集分析，今天，我们对这部分的内容作一些补充

主要介绍一下 GEVA、ssGSEA 和单基因的富集分析

GSVA

我们知道，GSEA 富集分析方法是针对两组样本来进行评估的，也就是说对基因列表的排列方式是根据基因与表型的相关度（例如，FC 值）来计算的，无法对单个样本使用

其富集分数（Enrichment Score，ES）的计算方式为

依次判断基因列表中的基因是否在基因集合中，如果在基因集合中，则 ES 加上该基因与表型的相关度，如果不是集合中的基因，则减去对应的值，最后可以计算出一个最大 ES。

Gene Set Variation Analysis（GSVA）与 GSEA 的原理类似，只是计算每个基因集合在每个样本中的 enrichment statistic（ES，或 GSVA score），其算法流程如下

不同于 GSEA 之处在于，对于不同的数据类型（只支持 log 表达值或原始的 read counts 值），假设了不同的累积密度函数（cumulative density function，CDF）

  1. 芯片数据：正态分布密度函数
  2. RNA-seq 数据：泊松分布密度函数

而且，GSVA 是为每个样本的每个基因计算对应的 CDF 值，然后根据该值对基因进行排序，这样，每个样本都有一个从大到小排序的基因列表

对于某一基因集合，计算其在每个样本中的 ES 值，也就是评估基因集合在基因列表中的富集情况。

例如，我们有一个排序后的样本

基因集合包含：B、E、H，我们可以绘制这样一张 K-S 分布图

x 轴为排序后的基因顺序，依照这一顺序，如果基因在集合内，则累积和会加上该基因的值（与基因的顺序有关，排名越靠前值越大），否则累积和不变。

将基因列表分为基因集内核基因集外两个集合，就可以绘制两个分布（红色和绿色曲线），分别计算两个分布之间的最大间距，以基因集内的分布值更大视为正间距（即红色曲线更高），两个最大间距之和即为该基因集的 ES 值

这样，就把基因水平的表达矩阵转换成了基因集水平的评分矩阵，可以使用差异表达基因识别算法，寻找显著差异的基因集，从而达到类似功能富集的作用

GSVA 分析

先获取基因表达矩阵，我们使用 TCGA 肺腺癌和肺鳞癌各 10 个样本的 read counts 数据

library(TCGAbiolinks)

get_prep <- function(cancer) {
  query <- GDCquery(
    project = cancer,
    data.category = "Transcriptome Profiling", 
    data.type = "Gene Expression Quantification", 
    workflow.type = "STAR - Counts",
    sample.type = c("Primary Tumor"),
  )
  # 选择 20 个样本
  query$results[[1]] <-  query$results[[1]][1:20,]
  GDCdownload(query)
  # 获取 read count
  exp.count <- GDCprepare(
    query,
    summarizedExperiment = TRUE,
  )
  return(exp.count)
}

luad.count <- get_prep("TCGA-LUAD")
lusc.count <- get_prep("TCGA-LUSC")

dataPrep_luad <- TCGAanalyze_Preprocessing(
  object = luad.count,
  cor.cut = 0.6,
  datatype = "unstranded"
)

dataPrep_lusc <- TCGAanalyze_Preprocessing(
  object = lusc.count,
  cor.cut = 0.6,
  datatype = "unstranded"
)
# 合并数据并使用 gcContent 方法进行标准化
dataNorm <- TCGAanalyze_Normalization(
  tabDF = cbind(dataPrep_luad, dataPrep_lusc),
  geneInfo = TCGAbiolinks::geneInfoHT,
  method = "gcContent"
)
# 分位数过滤
dataFilt <- TCGAanalyze_Filtering(
  tabDF = dataNorm,
  method = "quantile",
  qnt.cut =  0.25
)

gene.counts <- as.data.frame(dataFilt) %>%
    tibble::rownames_to_column("gene_id") %>%
    inner_join(dplyr::select(TCGAbiolinks::get.GRCh.bioMart("hg38"), gene_id, gene_name) 
               %>% mutate(gene_id = str_remove(gene_id, "\\.\\d+"))) %>%
    dplyr::select(-gene_id) %>%
    group_by(gene_name) %>%
    summarise_all(mean) %>%
    tibble::column_to_rownames(var = "gene_name") %>%
    rename_with(function(x) substr(x, 1, 12))
# 将数据拆分
luad.exp <- dplyr::select(gene.counts, substr(luad.count$barcode, 1, 12))
lusc.exp <- dplyr::select(gene.counts, substr(lusc.count$barcode, 1, 12))

我们使用 GSVA 包提供的 gsva 函数来将基因表达矩阵转换为基因集分数矩阵

library(GSVA)
library(GSEABase)

# 读取从 GSEA 官网下载的通路数据
c2gmt <- getGmt("~/Downloads/data/pathway/c2.cp.v7.2.symbols.gmt")
# 删选出常用的这三个数据库中的通路
gene.set <- c2gmt[grep("^KEGG|REACTOME|BIOCARTA", names(c2gmt)),]
# gsva 分析，read counts 使用泊松分布，通路至少包含 10 个基因
gs.exp <- gsva(as.matrix(gene.counts), gene.set, kcdf = "Poisson", min.sz = 10)

虽然 GSVAdata 包提供了通路数据 c2BroadSets 是基因 ID，但我们的基因表达数据的行是基因 Symbol，所以通路信息也必须是 Symbol 格式，要进行格式转换，比较麻烦

所以我们使用 GSEABase 包提供的 getGmt 函数来读取从 GSEA 官网下载的 C2 通路信息

得到结果如下，共包含 1642 条通路

然后，使用差异基因识别方法

差异分析

我们使用 limma 分析差异通路

DEA.gs <- TCGAanalyze_DEA(
  mat1 = gs.exp[, colnames(luad.exp)],
  mat2 = gs.exp[, colnames(lusc.exp)],
  metadata = FALSE,
  pipeline = "limma",
  Cond1type = "LUAD",
  Cond2type = "LUSC",
  fdr.cut = 0.05,
  logFC.cut = 0.5,
)

通过设置 FDR = 0.05，logFC = 0.5 共筛选出 13 条差异通路

查看通路的火山图
请添加图片描述

我们可以一起看下基因的火山图

DEA.gene <- TCGAanalyze_DEA(
  mat1 = luad.exp,
  mat2 = lusc.exp,
  metadata = FALSE,
  pipeline = "limma",
  Cond1type = "LUAD",
  Cond2type = "LUSC",
  fdr.cut = 0.01,
  logFC.cut = 1
)

在这里插入图片描述

总共识别出 3157 个差异表达基因

ssGSEA

single sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA) 是针对单个样本进行 GSEA 分析，其基因列表的排序方式和 ES 的计算方式都是依赖于样本中基因的表达值，而不再是依赖基因与表型的相关度

使用方式也很简单，只要在 gsva 函数中指定 method = "ssgsea"，例如

res.ssgsea <- gsva(as.matrix(gene.counts), gene.set, method = "ssgsea", kcdf = "Poisson", min.sz = 10)

也可以进行差异分析

DEA.ssgsea <- TCGAanalyze_DEA(
  mat1 = res.ssgsea[, colnames(luad.exp)],
  mat2 = res.ssgsea[, colnames(lusc.exp)],
  metadata = FALSE,
  pipeline = "limma",
  Cond1type = "LUAD",
  Cond2type = "LUSC",
  fdr.cut = 0.05,
  logFC.cut = 0.1,
)

或者绘制热图

annotation_col <- data.frame(sample = rep(1:2, each = 20))
rownames(annotation_col) <- c(colnames(luad.exp), colnames(lusc.exp))
pheatmap::pheatmap(
    res.ssgsea[rownames(DEA.ssgsea), rownames(annotation_col)],
    show_colnames = F,
    # 不展示行名
    cluster_rows = F,
    # 不对行聚类
    cluster_cols = F,
    # 不对列聚类
    annotation_col = annotation_col,
    # 加注释
    cellwidth = 5,
    cellheight = 5,
    # 设置单元格的宽度和高度
    fontsize = 5
)

单基因富集分析

单基因富集分析并不是说拿单个基因来进行富集分析，单个基因怎么能进行富集分析呢？一个基因根本没法进行统计检验。

其实，这里说的单基因并不是拿单个基因来富集，而是基于单个基因来进行富集分析，这个“基于”，就是以单个基因为基础，向外扩展，抓取与其相关的基因，然后用这些相关的基因来进行功能富集

所以，要理解这个单基因富集分析的意思，这样一说就已经很明了了。针对单个基因我们可以做什么？

主要有两种做法：

  1. 定性分组：我们可以根据给定基因的表达值对样本进行分组，然后识别在两组样本之间差异表达的基因，最后用这些差异表达基因来进行功能富集

  2. 定量相关：通过计算其他基因与目标基因表达之间的相关性，将具有显著相关的基因作为一个集合，也可以进行富集分析

定性分组

我们以 CCDC134 基因为例，以该基因表达值的中位值来对样本进行分组

gene <- "CCDC134"
gene.exp <- gene.counts[gene,] %>%
    t() %>% as.data.frame() %>%
    mutate(label = ifelse(!!sym(gene) < median(!!sym(gene)), 0, 1))

group.low <- gene.counts[,gene.exp$label == 0]
group.high <- gene.counts[,gene.exp$label == 1]

识别两组样本之间的差异表达基因

DEGs <- TCGAanalyze_DEA(
  mat1 = group.low,
  mat2 = group.high,
  metadata = FALSE,
  pipeline = "limma",
  Cond1type = "CCDC134_Low",
  Cond2type = "CCDC134_High",
  fdr.cut = 0.01,
  logFC.cut = 1,
)

共识别出 710 个差异表达基因

富集分析

对差异基因进行富集分析

library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
library(enrichplot)

gene.id <- bitr(
    rownames(DEGs), fromType = "SYMBOL",
    toType = "ENTREZID",
    OrgDb = org.Hs.eg.db
)
go <- enrichGO(
    gene = gene.id$ENTREZID,
    OrgDb = org.Hs.eg.db,
    ont = "ALL",
    pAdjustMethod = "BH",
    qvalueCutoff = 0.05,
    readable = T
)
dotplot(go)

GSEA 富集

gene_info <- DEGs %>%
  rownames_to_column(var = "SYMBOL") %>%
  inner_join(., gene.id[,1:2], by = "SYMBOL") %>%
  # 必须降序
  arrange(desc(logFC))

# 构造输入数据格式
geneList <- gene_info$logFC
names(geneList) <- as.character(gene_info$ENTREZID)

go2 <- gseGO(
  geneList     = geneList,
  OrgDb        = org.Hs.eg.db,
  ont          = "ALL",
  minGSSize    = 10,
  maxGSSize    = 500,
  pvalueCutoff = 0.1,
  verbose      = FALSE
)
dotplot(go2)

定量相关

我们计算 CCDC134 基因与其他基因的相关性，筛选出相关系数的绝对值大于 0.6 的基因，共筛选出 37 个基因。

cor.genes <- cor(t(gene.counts), as.numeric(gene.exp$CCDC134)) %>%
    as.data.frame() %>%
    tibble::rownames_to_column("gene") %>%
    rename_with(.cols = 2, ~"corr") %>%
    arrange(-corr) %>%
    dplyr::filter(gene != "CCDC134")

high.cor <- cor.genes %>%
    dplyr::filter(abs(corr) > 0.6)

富集分析

使用高度相关的基因进行富集分析

go <- enrichGO(
    gene = high.cor$gene,
    OrgDb = org.Hs.eg.db,
    keyType = "SYMBOL",
    ont = "ALL",
    pAdjustMethod = "BH",
    qvalueCutoff = 0.05,
    readable = T
)
dotplot(go)

根据相关性的大小排序，然后进行 GSEA 分析

# 构造输入数据格式
geneList <- cor.genes$corr
names(geneList) <- as.character(cor.genes$gene)

go2 <- gseGO(
    geneList     = geneList,
    OrgDb        = org.Hs.eg.db,
    keyType      = "SYMBOL",
    ont          = "ALL",
    minGSSize    = 10,
    maxGSSize    = 500,
    pvalueCutoff = 0.1,
    verbose      = FALSE
)
dotplot(go2)

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GSVA基因集打分/多通路limma差异分析流程及可视化学习和整理
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GSVA（Gene Set Variation Analysis，基因集变异分析） 是一种无监督的基因集富集分析方法，用于评估样本层面上基因集（如 KEGG 路径、GO 术语）的表现。与传统的基因集富集分析不同，GSVA 不是直接检测不同基因集在不同实验条件下的富集程度，而是计算每个样本中预定义的基因集的富集得分，从而评估基因集在不同样本或条件下的变异性。
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当 abs.ranking= TRUE时,将使用原始的Kuiper统计量，即使用极值的随机游走偏差和计算富集得分，该情况下，上调或下调的基因富集显著的基因集被认为是高度激活的;值得注意的是，这里的gsva函数接受的是一个纯粹的表达矩阵matrix和一个纯粹基因集合list，实际上通常是一个 ExpressionSet 和 GeneSetCollection 对象，所以大家务必学会R里面的对象哈，不然永远只能看懂简单代码。这样的差异分析结果同样也是可以画火山图，热图，代码就不赘述了，非常简单。
GSA、GSEA、ssGSEA、GSVA的算法原理及它们的联系与区别
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以上我们详细阐述了GSA、GSEA、ssGSEA、GSVA的算法原理，这应该是中文互联网最详细的GSEA、ssGSEA、GSVA的算法原理的阐述。可以看到除了GSA是基于超几何分布，后三者都是基于k-s test。GSEA开启了使用k-s test检验基因集富集的大门，ssGSEA提供了单样本的视角，并且引入rank normalization避免结果受基因表达的异常值的影响。GSVA相比ssGSEA，引入了核密度估计，用分布函数值代替基因表达值，并且提供了ES(S)的新的计算方法。
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ORA和GSEA。通常都是需要一个基因集才可以做。单个基因能做富集分析吗？肯定是不行的，所以需要我们用间接的方法实现。这个思路同样也适用于其他分子，比如lncRNA，比如miRNA（miRNA其实应该是找靶基因做，这样更合理）。下面我们进行演示，我们选择HOPX这个基因，来自一篇文章：https://doi.org/10.1186/s12935-023-02962-2。
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最近好多文章都是以单个基因为中心，干湿结合发一篇分值蛮高的 SCI 论文，这个同样也是目前的一个趋势，单个基因在 pan-cancer中的分布情况，比如功能，临床预测预后等，都是一个方向，精细分析一个基因将是个性化诊疗的一个方向。我们看到发在frotiers上的一篇文章，就是单基因生信分析的这个思路。
一文掌握单基因GSEA富集分析 | gseaGO and gseaKEGG
BioinfoDu
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给定一个排序的基因表L和一个预先定义的基因集S (比如编码某个代谢通路的产物的基因, 基因组上物理位置相近的基因，或同一GO注释下的基因)，GSEA的目的是判断S里面的成员s在L里面是随机分布还是主要聚集在L的顶部或底部。这些基因排序的依据是其在不同表型状态下的表达差异，若研究的基因集S的成员显著聚集在L的顶部或底部，则说明此基因集成员对表型的差异有贡献，也是我们关注的基因集。GSEA用来评估一个预先定义的基因集的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势，从而判断其对表型的贡献。其输入数据包含两部分，
论文研究 - TCGA队列中肺癌患者的生存分析
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肺癌是世界范围内主要的死亡原因之一，2018年估计有210万病例。为分析肺癌存活的危险因素，本文采用两种主要模型：Kaplan-Meier估计量和Cox比例风险模型[ 1]。 同样，利用对数秩检验和瓦尔德检验来检验是否存在相关性，这将在本文的后面部分详细讨论。 目的是找出影响肺癌患者生存率的最重要因素。 总结结果，癌症的阶段一直是肺癌生存的重要因素，在分析来自TCGA的数据样本中患者的生存率时，必须考虑时间。 还需要对肺癌进行进一步的研究以改善肺癌的治疗方法，因为我们的数据样本可能无法代表诊断为肺癌的患者的整体状况； 同样，应采用更合适和更高级的模型，以详细反映可能影响肺癌患者生存率的因素。
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通常，在识别完了差异基因之后，都会对差异基因进行功能富集，来获取差异基因参与的潜在生物学功能通路或生物学进程，有助于理解基因之间的作用关系以及发现基因在癌症发生发展过程中发挥的作用。通路，通常是一些已知的功能相关的基因集合，而我们常说的基因集合，一般是忽略了基因之间互作关系的通路。最常见的通路富集，是使用GO和KEGG数据库中预定义的生物学通路。
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大家好！今天跟大家分享的是2020年5月发表在Frontiers in Oncology（IF = 4.848）上的文章。文章利用了从TCGA及GEO数据库中搜集的胃癌（Gastric Cancer，GC）表达谱数据进行了LUM表达分析及荟萃分析，通过临床收集的GC样本进行验证，后续利用卡方检验、Logistic回归分析、生存曲线分析和单因素、多因素Cox回归分析，说明了LUM在GC进展过程中起到...
ssgsea富集分析代码
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SSGSEA（Single-sample Gene Set Enrichment Analysis）是一种基于基因集富集分析的方法，可以对单个样本进行基因表达谱的分析。以下是一个Python实现的SSGSEA富集分析代码示例： ```python import numpy as np from scipy.stats import norm def ssgsea(gene_exp, gene_sets, nperm=1000, weighted_score_type=1, permutation=True, min_size=1, max_size=5000, verbose=False, seed=None): """ :param gene_exp: array-like, shape (n_samples, n_features) Gene expression matrix (rows are samples and columns are features). :param gene_sets: dict Gene sets in the format of dictionary. Keys are pathway names and values are gene lists. :param nperm: int, optional The number of permutations for calculating the p-value. Default is 1000. :param weighted_score_type: int, optional The weighting score type. Default is 1. :param permutation: bool, optional Whether to do permutation for calculating the p-value. Default is True. :param min_size: int, optional The minimum number of genes in a gene set to be considered. Default is 1. :param max_size: int, optional The maximum number of genes in a gene set to be considered. Default is 5000. :param verbose: bool, optional Whether to print the progress. Default is False. :param seed: int, optional The seed for the random number generator. Default is None. :return: dict A dictionary of pathway names and enrichment scores. """ # Initialize the random number generator if seed is not None: np.random.seed(seed) # Prepare the gene expression matrix gene_exp = np.array(gene_exp) # Prepare the gene set list gene_sets = {k: v for k, v in gene_sets.items() if min_size <= len(v) <= max_size} # Compute the gene set scores pathways = {} for pathway, genes in gene_sets.items(): # Compute the gene set score for each sample gss = [] for i in range(gene_exp.shape[0]): # Get the gene expression values for the pathway genes pathway_exp = gene_exp[i, np.isin(gene_exp.columns, genes)] # Compute the gene set score if weighted_score_type == 0: gss.append(pathway_exp.sum()) elif weighted_score_type == 1: gss.append(pathway_exp.mean()) elif weighted_score_type == -1: gss.append(pathway_exp.abs().mean()) # Compute the enrichment score and p-value if permutation: null_gss = [] for i in range(nperm): # Shuffle the gene expression values shuffle_exp = gene_exp.apply(np.random.permutation, axis=1) # Compute the gene set score for each sample null_gss.append(shuffle_exp.apply(lambda x: x[np.isin(gene_exp.columns, genes)].mean(), axis=1)) null_gss = pd.concat(null_gss, axis=1) null_es = null_gss.apply(lambda x: (x > gss).mean() - (x < gss).mean()) es = (gss - null_es.mean()) / null_es.std() pval = (null_es < gss).mean() else: es = (gss - gss.mean()) / gss.std() pval = 1 - norm.cdf(es) pathways[pathway] = {'es': es, 'pval': pval} if verbose: print('%s: ES = %.3f, p-value = %.3f' % (pathway, es, pval)) return pathways ``` 该代码使用了NumPy和SciPy库进行计算。在使用时，需要将基因表达谱和基因集传递给`ssgsea`函数。此外，还可以设置其他参数，例如是否进行置换和置换次数等。函数返回一个包含富集分析结果的字典。
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