项目文章 | Cell Reports&ChIP-seq和RNA-seq联合鉴定伯克霍尔德氏菌毒性的重要调节因子

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发表单位：中山大学深圳校区药学院(深圳)
发表日期：2024年5月14日
研究期刊：Cell Reports（IF: 8.8）
研究材料：伯克霍尔德氏菌
主要技术：ChIP-seq，EMSA，微尺度热泳分析，RNA-seq， RT-qPCR

近日，中山大学深圳校区药学院(深圳)邓音乐教授研究团队在Cell Reports上发表了题为“Regulation of Burkholderia cenocepacia virulence by the fatty acyl-CoA ligase DsfR as a response regulator of quorum sensing signal” 的研究论文，该研究以伯克霍尔德氏菌为研究材料，揭示了脂酰辅酶A合成酶DsfR作为群体感应信号的响应调节因子，调控伯克霍尔德氏菌的毒性。研究结果进一步阐明了群体感应信号传导的机制，为研发新型抗感染药物提供了新的策略。爱基百客为该研究提供了ChIP-seq技术支持。

研究背景

群体感应(Quorum Sensing, QS)是自然界中存在的一种细菌之间的通讯系统，能够感知细胞密度的变化、自诱导动态调控相关基因的表达。群体感应系统在不同微生物种类中存在形式不同，主要表现在信号分子合成酶、信号分子、信号分子识别受体和启动子的不同。其中，革兰氏阴性菌中的LuxI/LuxR系统研究最为透彻。信号分子合成酶LuxI可以合成酰基高丝氨酸内酯（AHLs）作为信号分子，AHLs顺浓度梯度自由进出细菌，当其在胞外积累一定浓度后，AHLs会再次进入细菌内部与LuxR结合形成二聚体，然后与启动子PluxI的lux box区域结合从而调控后续基因的表达。

伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia, BC）是20世纪40年代由康奈尔大学教授Burkholder最初从腐烂的洋葱鳞茎分离出的一种革兰氏阴性菌，广泛存在于水、土壤和植物中，也可附着在人的痰液和组织标本、医疗器械表面如呼吸机、导管、支气管镜等，对有机溶剂、防腐剂及低营养条件的耐受性较高，可通过接触或吸入气溶胶传播，是院感的重要机会性致病菌。群体感应也是许多病原微生物完全发挥其毒力所必需的，有研究表明伯克霍尔德氏菌可利用顺式-2-十二烯酸（Burkholderia DSF，BDSF）和N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）两种QS系统调节其生理和毒性，其中BDSF通过激活RpfR蛋白的磷酸二酯酶活性，降低细胞内环二聚鸟苷酸（c-di-GMP）水平，从而增强RpfR-GtrR复合物的转录调控活性，其原理如图1所示。

脂肪酸是生物体的重要组成部分，其激活通常由脂肪酰辅酶A连接酶催化，通过形成酰基-腺苷酸中间体（酰基-AMP）并生成脂肪酰辅酶A硫酯。研究发现，脂肪酰辅酶A连接酶BCAM2136（DsfR）不仅能将脂肪酸转化为脂肪酰辅酶A，还作为调控因子控制伯克霍尔德氏菌的重要生物功能和毒性。BDSF能增强DsfR的调控活性，控制目的基因的表达。DsfR的同源物在伯克霍尔德氏菌中也具有类似功能，表明DsfR可能是细菌中BDSF QS信号受体家族的一员，本研究则对这一推测进行了深入研究。

图1 伯克氏菌感应BDSF信号及其传导通路

研究思路

研究结果

一. DsfR控制伯克霍尔德氏菌的毒力相关表型

BclACB操纵子由BDSF和CepIR群体感应系统控制，与生物膜形成和致病性相关。在鉴定的基因中，作者发现了一个长链脂酰辅酶A连接酶（BCAM2136，命名为DsfR），然而，DsfR的功能和调控机制尚不清楚（图2A）。为了研究伯克霍尔德氏菌中DsfR的调控机制，作者将bclACB操纵子的启动子区域与报告基因lacZ（编码β-半乳糖苷酶）融合，并将其构建到一个质粒，并通过X-gal实验来检测活性β-半乳糖苷酶的存在，从而去验证启动子的活性。当dsfR插入突变体在含bclACB操纵子-lacZ融合质粒的平板上呈现浅蓝色菌落，作者假设DsfR可能控制bclACB操纵子的表达。

为了验证这一点，作者在dsfR缺失突变体中构建了PbclACB-lacZ报告系统。通过测量β-半乳糖苷酶活性发现，dsfR缺失突变体中bclACB的表达显著低于野生型菌株，表明DsfR正向调控bclACB的表达（图2B）。此外，dsfR缺失突变体的生物膜形成、运动性和毒力分别降低至野生型菌株的61.07%、36.09%和46.35%，这表明DsfR通过群体感应系统调控相关的表型（图2C-E）。

总结而言，DsfR在伯克霍尔德氏菌中通过调控bclACB操纵子的表达，影响生物膜形成、运动性和毒力，这表明了DsfR是这些致病性特征的重要调控因子。

图2 dsfR对QS调控表型的影响

二. DsfR 作为一个转录调控因子，调控着群体感应和多种基因的表达

为了研究DsfR是否会影响QS信号系统，作者在伯克霍尔德氏菌的dsfR突变株构建了PcepI-lacZ、PcepR-lacZ、PrpfFBc-lacZ和PrpfR-lacZ报告系统。结果显示，dsfR的缺失降低了cepI、cepR、rpfFBc和rpfR的表达，这些基因分别编码AHL和BDSF QS系统的信号分子合成酶（cepI和rpfFBc）和受体基因（cepR和rpfR）（图3A-3D）。RT-qPCR分析也显示，dsfR的突变导致cepI、cepR、rpfFBc和rpfR的表达水平降低（图3E）。进一步测量显示，与野生型菌株相比，dsfR突变株中C8-AHL、C6-AHL和BDSF的产生量显著降低，c-di-GMP的细胞内水平升高，而在dsfR的回补株中这些信号则恢复到了的正常的表达水平（图3F）。此外，作者通过RNA测序（RNA-seq）分析比较了野生型菌株和dsfR突变株的基因表达水平。结果显示，与野生型菌株相比，dsfR突变株中有47个基因的表达上调，96个基因的表达下调（|log2倍变化| ≥ 1.5），这些基因涉及信号转导、氨基酸代谢和致病性等生物功能。总结而言，DsfR不仅调控QS系统基因的表达，还影响多种生物学功能。

图3 DsfR对伯克霍尔德氏菌靶基因的调控分析

三. DsfR的亮氨酸拉链基序负责与启动子DNA结合

前面的研究表明DsfR显著影响伯克霍尔德氏菌中多个群体感应基因的转录水平，那具体的机制是什么呢？带着这样的疑问，作者通过EMSA和MST实验证明了DsfR直接与cepI、rpfFBc和bclACB等基因的启动子结合，并调节其表达。ChIP-seq数据进一步证明DsfR直接结合到基因启动子区域，调节对应基因的转录（图3H-3Q）。

接着，作者又通过SMART和蛋白质基序分析网站分析，DsfR具有N-AMP结合结构域（DsfR-A），包含一个亮氨酸拉链基序，以及AMP结合酶C末端结构域（DsfR-B）。利用HDOCK服务器预测DsfR与DNA结合位点的相互作用，并通过EMSA实验进一步去验证这一预测（图4A-4B）。结果表明，DsfR-A结构域能与DNA启动子片段结合，而DsfR-B不能（图4C-4I）。进一步的突变分析显示，DsfR-A结构域中的亮氨酸拉链基序对其DNA结合至关重要，突变后无法形成DNA-蛋白质复合物，证明亮氨酸拉链在DsfR调控基因表达中起关键作用（图4J-4K）。

图4氨酸拉链基序对DsfR与启动子结合的影响

四. 在群体感应信号系统中， DsfR是BDSF的特异性受体

由于DsfR作为调控因子控制QS表型再结合前人的研究成果，所以作者推测了DsfR是否是与BDSF或AHL结合来控制生物学功能，还是与这两者都结合来控制生物学功能。为了验证这一假设，作者进行了微尺度热泳(MST)分析，以测试DsfR是否结合BDSF或AHL信号。结果发现DsfR与BDSF结合，解离常数（KD）为8.28 ± 0.96 µM，而不与C8-AHL或C6-AHL结合。DsfR对BDSF类似物DSF的结合较弱（KD = 26.32 ± 0.93 µM），对饱和BDSF异构体月桂酸的亲和力更低（KD = 131 ± 2.47 µM）（图5A-5C）。接着又通过构建双重和三重缺失突变体，研究发现外源性BDSF可以恢复双重突变体的生物膜形成、运动性和毒力。有趣的是，在三重突变体DrpfFBcDrpfRDdsfR中，由于不仅缺少了DsfR，还缺少了其他两个基因，因此外源BDSF无法恢复这些突变体的功能（图5D-5F）。这表明DsfR是BDSF的特异性受体，能够调控伯克霍尔德氏菌中的生物功能。

图5 DsfR是BDSF的受体

五. BDSF增强了DsfR与靶基因启动子的结合

为了研究BDSF与DsfR的结合如何影响DsfR的活性，研究人员通过电泳迁移率变动分析（EMSA）检测了BDSF对DsfR结合cepI、rpfFBc和bclACB启动子的影响。结果显示，BDSF增强了DsfR对这些启动子的结合，且随着BDSF浓度的增加，DsfR与探针的结合量也增加（图6A-6C）。而外源加入的DSF（BDSF的类似物）和饱和的BDSF异构体月桂酸并未影响DsfR与这些启动子的结合，表明DsfR是BDSF的特异性响应调节器。

接着，作者尝试鉴定出BDSF在DsfR中的直接结合位点。MST显示，BDSF与DsfR的DsfR-A域结合。Autodocking显示DsfR-A域中两个可能与BDSF相互作用的重要氨基酸残基：Thr191（T191）和Lys196（K196）。为了检测这两个残基在BDSF结合中的作用，作者生成了两个单点突变体。分析结果表明，突变体DsfRT191A无法与BDSF结合，而K196突变显著削弱了DsfR与BDSF的结合（图6I-6J）。

此外，体内表达的dsfRT191A和dsfRK196A仅部分恢复了双重突变体的生物膜形成和运动性，外源加入20 mM BDSF对这些突变体的表型没有影响（图6K-6L）。与此一致的是，突变BDSF结合位点（K196A和T191）的效果完全消除了BDSF的作用。

总结起来，BDSF特异性地与DsfR结合，且增强了DsfR对目标基因启动子的结合，DsfR的两个氨基酸残基T191和K196在与BDSF结合中起关键作用。

图6 BDSF对DsfR与启动子结合的影响

结论

这篇文章研究了伯克霍尔德氏菌的毒力调控机制。通过研究脂酰辅酶A连接酶DsfR通过结合BDSF信号，其对靶基因启动子的结合，促进群体感知信号系统的活性，进而影响细菌的生物膜形成、运动性和毒力，从而调控其病原性。未来，可进一步探究DsfR在其他生理过程中的作用，并探索其作为潜在治疗靶点的可能性，以深入理解和应用细菌的毒力调控机制。