看不见的甲基化效应——甲基化检测技术助力解析表观遗传现象

一、为何看不见DNA序列改变，却能造成遗传差异？

DNA甲基化是一种独特的遗传调控机制，它在不改变基因组DNA的核苷酸序列的前提下，能够引起基因表达的遗传性变化。这一过程主要通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）的作用，在胞嘧啶的5号碳原子上添加甲基基团来实现。这种表观遗传修饰在生物界中广泛存在，是一种既保守又可逆的调控方式。

在生物体内，DNA甲基化水平通过甲基化和去甲基化的动态平衡来维持。具体来说，DNA甲基化的过程可以细分为两种类型：一是从头甲基化，即在原本未甲基化的DNA位点上建立新的甲基化模式；二是维持甲基化，即在DNA复制过程中保持原有的甲基化模式。相应地，DNA去甲基化也分为两种形式：主动去甲基化，这是一种有意识的去甲基化过程，涉及特定的酶来移除甲基基团；被动去甲基化则通常发生在细胞分裂过程中，由于DNA复制后新合成的链未能及时甲基化，导致甲基化水平的自然下降。

这四种关键的甲基化和去甲基化过程，均由一系列特定的酶来催化完成，它们共同参与调控基因的表达，影响细胞命运和生物体的发育。

01植物DNA甲基化机制

植物建立甲基化是由RdDM（RNA-directed DNA methylation）途径介导的，RdDM途径是植物特有进行甲基化修饰的重要途径。RdDM途径是由小RNA（siRNA）介导的转录水平基因沉默（Transcriptional gene silencing, TGS）调控途径，需要两种特定的RNA聚合酶，Pol Ⅳ和Pol Ⅴ。典型的RdDM途径涉及以下步骤：Pol Ⅳ在靶位点转录出单链RNA（single-stranded RNAs, ssRNAs），经过RDR2复制成双链RNA（dsRNAs），再经过DCL3（DICER-LIKE 3）剪切加工成24nt的siRNAs运输到细胞质中，然后结合到AGO4（Argonaute 4）上重新运输回细胞核，与Pol Ⅴ转录形成的新的长链RNA转录本互补，该长链转录本与AGO4-siRNA复合体一起招募DRM2在特定的靶位点进行甲基修饰。

图1 植物建立甲基化途径RdDM

Matzke MA, Mosher RA. RNA-directed DNA methylation: an epigenetic pathway of increasing complexity. Nat Rev Genet, 2014, 15(6):394-408

植物维持甲基化是由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase 1, MET1）、染色质甲基酶（chromomethylase 3, CMT3）、CMT2等酶催化完成的。CG、CHG、CHH等不同的序列环境由不同的甲基化酶催化。

植物主动去甲基化的过程主要由ROS1、DME、DML2和DML3等一系列去甲基化酶催化，通过DNA的糖基化和裂解作用消除甲基化修饰。当DNA复制完成后缺乏DNA甲基转移酶维持甲基化修饰状态或者当甲基化酶缺乏活性时，则诱导被动去甲基化，甲基化胞嘧啶被未甲基化胞嘧啶取代。

图2 植物DNA甲基化动态机制

Zhang H, Lang Z, Zhu JK. Dynamics and function of DNA methylation in plants. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018 Aug;19(8):489-506.

02动物DNA甲基化机制

在哺乳动物中，有两种主要的DNA甲基化酶DNMT3A和DNMT3B催化建立甲基化，最近的基因筛选发现了一种新的甲基化酶DNMT3，在控制逆转录转座子方面发挥着特殊作用。另外，还有一种DNMT催化活性辅助因子DNMT3L，与DNMT3A和DNMT3B相互作用并刺激其活性。DNA甲基化酶的羧基末端包含一个高度保守的DNMT结构域（MTase结构域）和两个染色质读取结构域，ATRX-DNMT3-DNMT3L (ADD)和 PWWP。组蛋白H3K4残基的甲基化修饰越多对ADD结构域的排斥作用增强，这时ADD会结合MTase结构域，抑制DNMT3甲基化酶的活性，进而减少对启动子的甲基化修饰作用，启动子的活性增强。当未甲基化的H3K4与ADD结合，释放MTase活性，实现DNA甲基化。与启动子甲基化修饰减少导致基因转录活性提升的情况相反，Gene body区域甲基化修饰作用增强。这是由于RNA聚合酶II (Pol II)转录时，H3K36三甲基化与PWWP结构域结合，释放MTase促进甲基化修饰。

从头DNA甲基化可以在任何序列环境中发生，但只有对称CpG甲基化在DNA复制时可以维持甲基化状态。甲基化酶DNMT1与另一种多结构域蛋白E3泛素蛋白连接酶UHRF1协同介导甲基化的维持。DNMT1本身具有自抑制性，不具备甲基化酶活性。UHRF1的SRA和RING结构域锚定复制过程的半甲基CpG双核苷酸；TTD-PHD结构域特异性结合H3K9me2和H3K9me3；UBL结构域招募DNMT1释放其自抑制作用。DNMT1的RFTS结构域定位到组蛋白H3尾部，MTase在锚定的CpG位置甲基化子DNA链。

主动DNA去甲基化由TET甲基胞嘧啶双加氧酶进行，该酶逐渐将5mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC) 和5-羧基胞嘧啶(5caC)。全基因组DNA去甲基化是一个仍需要深入挖掘的研究领域。据报道，在人和小鼠生殖系重编过程中发生两步去甲基化。第一阶段，大部分基因组被动去甲基化；随后由TET1和TET2去甲基化酶介导去甲基化，主要影响基因印迹位点和生殖系特异性基因。

图3 动物DNA甲基化建立和维持

图4 DNA甲基化酶和去甲基化酶结构

Greenberg MVC, Bourc'his D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Oct;20(10):590-607.

二、DNA甲基化检测技术

为何存在甲基化差异，一般却看不见表型变化？

在DNA甲基化对下游通路的调控过程中，作用途径、作用基因的关键性、甲基化修饰的位置区域、修饰水平等等因素都可能引起表型或遗传变化程度的差异。差异甲基化区域少、修饰水平低等造成的综合遗传效应较小，一般不易形成明显的表型改变，但是甲基化修饰的改变确是真切存在，可能在多代遗传后会引起较大的遗传差异。

01DNA甲基化检测技术简介

1925年，5-甲基胞嘧啶首次在细菌中被发现。自发现DNA甲基化至今已近一个世纪，DNA甲基化已在广泛的生物体中得到研究，并在基因调控、基因组组织、生殖发育以及疾病和衰老等生物学主题中被深入探究。但是，甲基化研究领域还有许多需要深入揭示的机制和调控网络。要解析这些甲基化相关研究难题，只能通过甲基化检测、高通量测序结合生物信息分析来揭示其中奥秘。近年来DNA甲基化研究取得了大量精细成果，离不开研究技术的创新。下面列举了一些用于不同目的研究的DNA甲基化检测技术。

表1 DNA甲基化检测技术（爱基百客可提供）

02WGBS测序结果示例

WGBS（全基因组甲基化测序，Whole Genome Bisulfite Sequencing）被公认为是DNA甲基化研究的金标准，在DNA甲基化测序中占据重要地位。它能够在全基因组范围内精确检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，提供单碱基分辨率的甲基化图谱，这是其他许多DNA甲基化检测技术所难以达到的。因此，WGBS被广泛应用于表观遗传学研究、疾病研究等多个领域。

以WGBS为例，爱基百客可提供从DNA提取到建库测序全流程服务，并基于以下分析流程给出全面精细的分析结果和可视化图。

图5 WGBS分析流程

图6 数据质控对比

图7 DMR分布分析

图8 关联基因GO聚类分析

图9 关联基因KEGG聚类分析

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