Tn5转座酶建库原理

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一、转座酶分类

Ⅰ型转座子：“复制-粘贴”模式，以DNA为模板，在RNA polⅡ作用下转录成mRNA，再反转录为cRNA，最后在整合酶作用下整合到基因组上的新位置。

Ⅱ型转座子：“剪切-粘贴”模式，Ⅱ型转座子从原来位置上解离下来，重新整合到染色体上。Tn5也属于这种转座子。

二、Tn5性质

• Tn5转座子序列[1]
  
  

Tn5转座子序列包含四个重要组分：

• IS50

IS50R上面的Tnp和Inh分别编码转座酶（Tnp）和转座抑制因子（Inh），Inh可与Tnp形成多聚体复合物进而抑制Tnp介导的转座；IS50L上面的P3和P4分别编码Tnp和Inh的无功能形式。

• Outside end（OE）sequences

OE序列由19个碱基组成，可被Tnp所识别，参与整个Tn5的转座

• Inside end（IE）sequences

IE序列不参与Tn5的转座（OE-OE），仅参与IS50的转座（IE-OE）

• Drug resistance genes

Tn5上的耐药基因主要有kan、str和bleo

• Tn5转座酶

Tn5来自大肠杆菌，Tnp序列全长477个氨基酸。Tn5 Tnp含有三个结构域：N末端、催化结构域和C末端。其中N末端包含70个氨基酸，组成许多α螺旋和β-转角用于DNA binding；Tnp活性中心位于中间300个氨基酸，包含一个“核糖核酸酶H样基序”、一个混有β片层结构的α/β/α折叠结构；C端完全由α螺旋组成，主要负责蛋白质-蛋白质相互作用。

Tn5转座复合体是一个同源二聚体，是由两个Tnp识别OE序列后二聚化，然后剪切供体DNA后形成的。

Tn5转座的基本原理

转座开始时，两个转Tnp识别结合Tn5转座子两端的OE序列，形成Tnp-OE复合物，然后两个Tnp-OE复合物相互结合，两Tnp的C端介导互作并形成具有切割DNA能力的二聚体突触复合物。Tnp活化附近水分子（Mg2+介导），活化水分子在转座子5‘端水解DNA的一条链并形成3’-OH亲核基团，3’-OH进一步攻击互补链形成发卡结构，在另一活化水分子的作用下形成平端。

在链转移过程中，Tn5转座复合体结合到DNA大沟上，Tnp活性中心的两个Mn2+负责催化亲核基团3‘-OH保持正确取向，通过3‘-OH亲核基团对DNA双链的亲核攻击完成链转移[2]。这涉及到磷酰基转移酶（eg. DNA polⅠ的Klenow片段）共有的“二价双离子机制”维持复合物正确空间构象。不同之处在于，在Klenow片段中，活性中心的两个金属离子是Mg2+，而在Tnp活性中心内是两个Mn2+，两个Mn2+和DDE基序配位形成“催化三联体”，共同催化磷酯键的转移[3]。在体外实验中，也可以将Tnp的两个Mn2+换成两个Mg2+。

一、Tn5建库原理

研究发现，Tn5转座酶可以仅识别OE序列在DNA中随机插入序列，完成体外的转座。根据这一原理，将测序的read1和read2加入OE序列中，Tnp识别并剪切含有OE序列的read1和read2序列后便可形成Tn5转座复合体。其中灰色的序列即为19bp的OE序列（也称为Mosaic End、MS序列）；蓝色：Nextera tn5 read1 (5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’)；红色：Nextera tn5 read2(5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3’)。

也有的Tn5 library preparation kit的read1和read2序列不在同一Tn5转座复合体上。

将Tn5转座复合体与DNA混合后，Tn5便可在DNA开放区域随机插入read1和read2序列，如下图所示：

Tn5转座复合体随机插入会产生三种产物，三种产物都会有一个9bp的gap，所以在PCR第一步，需要72℃，5min来进行gap filling。如下图所示：

在这之后，便可通过PCR引入P5和P7序列，如图所示：


当一段DNA两端都是read1或read2时（即上面提到的第1、2种产物），后续引入的P5和P7仅能连接到DNA的一端，扩增时会受到抑制，因此在最终产物中占到的比例很少，测序时会损失掉这部分DNA信息，损失掉的这部分DNA信息占总的50%[2]。PCR引入P5和P7后即可用于NGS测序。

一、Tn5使用及保存注意事项（Illumina DNA Prep）

1、推荐DNA Input

Illumina DNA Prep推荐的DNA Input 是1-500ng或更高。对于人类DNA样品或其他大的复杂基因组，推荐的最小DNA Input为100-500ng，而对于较小的基因组，DNA Input可减至1ng，（同时修改PCR参数）。（总的来说就是基因组越大越复杂，需要的Input就越多）。

对于DNA Input<100ng，在建库需要对初始DNA样品进行定量和标准化；

对于DNA Input为100ng~500ng，不需要对初始DNA样品定量和标准化。

2、推荐DNA Input长度

DNA Input通常需要大于1000bp，因此短片段不适用于Tn5建库[2]。

作者：DistantStellaris https://www.bilibili.com/read/cv12209970/ 出处：bilibili