重磅综述，关于RNA-seq，你想知道的都在这

摘要

 

RNA测序（RNA-seq）在过往十年里逐渐成为全转录组水平分析差异基因表达和研究mRNA差异剪接必不可少的工具。随着二代测序技术 (NGS)的发展，RNA-seq的应用也越来越广。现已经可以应用于很多RNA层面的研究，比如单细胞基因表达、RNA翻译（translatome）和RNA结构组（structurome结构组学）。新的有意思的应用，如空间转录组学（spatialomics）也在积极研究中。通过结合新兴的三代长读长long-read和direct RNA-seq技术，以及更好的计算分析工具，RNA-seq帮助大家对RNA生物学的理解会越来越全面：从转录本在何时何地转录到RNA折叠以及分子互作发挥功能等。

 

前言

 

RNA测序（RNA-seq）自诞生起就应用于分子生物学，帮助理解各个层面的基因功能。现在的RNA-seq更常用于分析差异基因（DGE, differential gene expression），而从得到差异基因表达矩阵，该标准工作流程的基本分析步骤一直是没有太大变化：

 

• 始于湿实验，提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。

• 然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序，每个样本测序reads深度为10-30 Million reads。

• 最后一步是计算：比对/拼装测序reads到转录本，计数与转录本比对上的reads数定量，样本间过滤和标准化，样本组间基因/转录本统计差异分析。

 

早期的RNA-seq实验从细胞群（如来源于某个组织或器官的细胞）中得到DGE数据，并可以应用于很多物种，如玉米(Zea mays)，拟南芥(Arabiodopsis thaliana)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)，鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)。虽然RNA-seq这个词通常包含很多不同的RNA相关的方法或生物应用，但DGE分析始终是它的主要应用（表1），并且是DGE研究的常规工具。

 

RNA-seq的广泛应用促进了对许多生物层面的理解，如揭示了mRNA剪接的复杂性、非编码RNA和增强子RNA调控基因表达的机制。RNA-seq的发展和进步一直离不开技术发展的支持（湿实验方面和计算分析方面），且与先前的基于基因芯片的技术比起来，获得的信息更多、偏好性更小。到目前为止，已从标准的RNA-seq流程中衍生出多达100种不同的应用。大部分应用都是基于Illumina short-read测序，但最近基于long-read RNA-seq和direct RNA sequencing (dRNA-seq)的方法可以帮助解决Illumina short-read技术处理不了的问题。

 

本文中，我们先熟悉'baseline'流程，用short-read RNA-seq技术分析DGE。先描述短读长测序的文库构建过程、实验设计注意事项和计算分析流程，探究其应用如此广泛的原因。然后描述单细胞转录组和空间转录组的发展和应用。我们会举例说明RNA-seq在RNA生物学关键研究中的应用，包括转录和翻译的动力学分析，RNA结构，RNA-RNA和RNA-蛋白质间相互作用等。最后我们小小地展望一下RNA-seq的未来，如单细胞和空间转录组是否也会是以后的常规分析，在什么情况下long reads会替代short reads RNA-seq。不过篇幅有限，本文对RNA-seq分析还是有照顾不到的地方，比如典型的有非编码转录组，原核转录组和表观转录组。

 

 

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