基因工程-6-阳性转化子的鉴定

目录

6.1遗传表型检测法

（1）抗药性筛选

（2）插入失活筛选

（3）蓝白斑筛选

6.2 酶切电泳检测

6.3 核酸分子杂交

6.3.1 Southern杂交

（1）核酸探针的制备

（2）核酸探针标记

（3）核酸探针标记方法

流程：

Southern blot流程总结

应用：

6.3.2 Northern印迹杂交

步骤：

注意事项：

6.3.3蛋白印迹分析

Western blot 流程：

6.5DNA序列测定

6.5.1 Sanger双脱氧链终止法

特性:

原理:

路线：

6.5.2化学降解法测序

技术路线：

6.5.3 DNA序列的自动测定

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6.1遗传表型检测法

（1）抗药性筛选

氨苄青霉素（Ampr）；

四环素抗性基因（Tetr）;

氯霉素抗性基因（Cmr,cat）；

卡那霉素抗性基因（Kanr）;

（2）插入失活筛选

插入之后引起载体功能改变。

常用插入失活法、插入表达筛选法、噬菌斑筛选法。

• 环丝氨酸筛选法——插入失活效应筛选
• 环丝氨酸结构与丝氨酸相近，细胞分裂时掺入到新合成的肽链中，影响折叠会导致生长的细胞致死。
• 四环素插入失活的重组子由于不抗四环素生长受抑制。

（3）蓝白斑筛选

 

6.2 酶切电泳检测

• （1）单酶切电泳检测
• （2）双酶切电泳检测
• （3）选取目的基因内部酶切位点电泳检测

6.3 核酸分子杂交

根据两条单链DNA或DNA与RNA中互补碱基序列能够专一配对的原理；

在一定条件下，利用已标注的目的基因的DNA或RNA片段作为探针，探测转化子受体细胞中是否有DNA或RNA片段与目的基因探针发生同源性杂交，经过适当检测，从而确定目的基因是否进入受体细胞基因组的方法。

6.3.1 Southern杂交

• >将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂交液进行预杂交，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
• >在特定溶液和温度下，将标记的核酸探针与滤膜结合。
• >经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去后，通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其相对分子质量。

（1）核酸探针的制备

用于核酸分子杂交的探针必须满足以下条件：

• 特异性片段；
• 单链结构（双链DNA可用碱变性）；
• 足够长度（一般以50-300bp为宜）；
• 内部不含互补区；

（2）核酸探针标记

同位素标记：P32;

非同位素标记：生物素、地高辛、荧光素等；