生信学习笔记：测序数据质控

测序数据质控

Illumina 测序属于第二代测序技术，单次运行能产生数十亿级的reads，如此海量的数据无法逐个展示每条read的质量情况；运用统计学的方法，对所测序列进行统计和质控，可以从宏观上直观地反映出样本的文库构建质量和测序质量。

1.原始数据统计

1）原始数据获得

Illumina 平台通过将测序图像信号经CASAVA碱基识别(Base Calling)转换成文字信号，并将其以 fastq 格式储存起来作为原始数据。根据index序列区分各个样本的数据，以便进行后续分析。在fastq文件中每条序列由4行数据组成，其中第一行和第三行为读段识别码（第一行以“@”开头，第三行以“+”开头），第二行为碱基序列，而第四行是第二行序列的各碱基所对应的测序质量值。

如下所示：

2）原始数据质控

对每一个样本的原始测序数据进行测序相关质量评估，包括：① 碱基质量分布统计； ② 碱基错误率分布统计；③ A/T/G/C碱基含量分布统计。

使用软件：fastx_toolkit_0.0.14。

① 碱基质量分布统计

测序的错误率与碱基的质量有关，受测序仪本身、测序试剂、样品等多个因素共同影响。通过公式计算，可以得出一个综合的值，即质量值(Q)，用来评估测序的质量。随着测序的进行，酶的活性及其它物质的灵敏度也会下降，因此到达一定测序长度后，Q值也会随之下降。

② 碱基错误率分布统计

测序错误率会随着测序序列(Sequenced Reads)长度的增加而升高，这是由测序过程中化学试剂的消耗导致的，为Illumina高通量测序平台的共有特征；另外，前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率，而这个长度也正好等于在RNA-seq建库过程中反转录所需要的随机引物的长度。这部分碱基的测序错误率较高可能是由于随机引物与RNA模版的不完全结合导致。

③ A/T/G/C碱基含量分布统计

碱基含量分布一般用于检测有无AT、GC分离现象。对于RNA-seq来说，鉴于序列打断的随机性和G/C、A/T含量分别相等的原则，理论上每个测序循环中的GC含量相等、AT含量相等(如果是链特异性建库，可能会出现AT分离和/或GC分离)，且在整个测序过程基本稳定不变，呈水平线。但在现有的高通量测序技术中，反转录合成 cDNA 时所用的6bp的随机引物会引起前几个位置的核苷酸组成存在一定的偏好性，这种波动属于正常情况。

2.质控数据统计

由于原始测序数据中会包含测序接头序列、低质量读段、N（N表示不确定碱基信息）率较高序列及长度过短序列，这将严重影响后续分析的质量。所以，在分析之前会先对原始测序数据进行质控，从而得到高质量的质控数据（clean data）以保证后续分析结果的准确性。

使用软件： SeqPrep 和 Sickle

具体步骤及顺序如下：

1. 去除reads中的接头序列，去除由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads；

2. 将序列末端（3’端）低质量（质量值小于20）的碱基修剪掉，如剩余序列中仍然有质量值小于10的碱基，则将整条序列剔除，否则保留；

3. 去除含N（模块碱基）的reads；

4. 舍弃去adapter及质量修剪后长度小于30bp的序列。

数据质控完成后，对质控后的数据再次进行统计以及质量评估，同样包括：

① 碱基质量分布统计；

② 碱基错误率分布统计；

③ A/T/G/C碱基含量分布统计。

接头序列为：

5’: AGATCGGAAGAGCACACGTC

3’: AGATCGGAAGAGCGTCGTGT

参考资料：
美吉生物云