RNA-seq流程学习笔记（9）-使用RSeQC软件对生成的BAM文件进行质控

参考文章：
用RSeQC对比对后的转录组数据进行质控
高通量测序质控及可视化工具包RSeQC
RSeQC使用笔记

1. 质控的原因及相关软件

在A survey of best practices for RNA-seq data analysis里面，提到了人类基因组应该有70%~90%的比对率，并且多比对read（multi-mapping reads）数量要少。另外比对在外显子和所比对链（uniformity of read coverage on exons and the mapped strand）的覆盖度要保持一致。因此，可以对之前得到的BAM比对文件进行质检。

对BAM文件进行QC的软件包括：

Qualimap：对二代数据进行质控的综合软件

Picard：综合质控学习软件。

RSeQC是发表于2012年的一个RNA-Seq质控工具，属于python包。提供了一系列有用的小工具能够评估高通量测序尤其是RNA-seq数据。比如一些基本模块：检查序列质量、核酸组分偏性、PCR偏性、GC含量偏性，还有RNA-seq特异性模块：评估测序饱和度、映射读数分布、覆盖均匀性、链特异性、转录水平RNA完整性等。

2. RSeQC软件安装

参照文章：RNA-seq流程学习笔记（3）
查看Conda官网Index的RSeQC软件介绍，发现支持python3.6版本，因此直接使用Miniconda3安装， 安装完成后并没有RSeQC这个软件，而是增加了一些python命令，如下：

虽然该软件的使用命令非常多，但很多功能并不是用来诊断转录组测序的，所以不在我们的考虑范围内。

3.RSeQC处理4种文件格式:

1. BED 格式：Tab 分割，12列的表示基因模型的纯文本文件。
2. SAM 或BAM 格式： 用来存储reads比对结果信息，SAM是可读的纯文本文件，然而BAM是SAM的二进制文本，一个压缩的可索引的reads比对文件。
3. 染色体大小文件： 只有两列的纯文本文件，在“生物信息学文本处理大杂烩(一)”里已经讲过。hg19.chrom_24.sizes是人基因组hg19版本的size文件，是使用UCSC 的fetchChromSizes下载的。
4. Fasta文件。
   我主要使用的是比对后得到的BAM格式文件。

4. RSeQC软件进行质控检测

1. 使用bam_stat.py命令查看比对的总体情况

#命令说明
Usage: bam_stat.py [options]
Summarizing mapping statistics of a BAM or SAM file.
Options:
  --version             show program's version number and exit
  -h, --help            show this help message and exit
  -i INPUT_FILE, --input-file=INPUT_FILE
                        Alignment file in BAM or SAM format.
  -q MAP_QUAL, --mapq=MAP_QUAL
                        Minimum mapping quality (phred scaled) to determine
                        "uniquely mapped" reads. default=30

#操作记录
(base) zexing@DNA:~/projects/zhaoxiujuan/aligned$ bam_stat.py -i Scr.bam.sort
Load BAM file ...  Done

#==================================================
#All numbers are READ count
#==================&#