单分子实时测序

单分子实时测序

最近，我目睹了各种下一代测序（NGS）平台的兴起，这很有趣，因为每个平台使用不同的方法。以前，我曾写过关于纳米孔测序的令人兴奋的可能性的信息-一种新的测序技术，该技术基于单链DNA穿过纳米孔时产生的“签名”电流。纳米孔测序技术的优势在于您可以获得实时测序结果。

今天，我要谈谈另一个不同的NGS平台，该平台还允许实时排序，但是它使用了不同的原理。听起来很酷吧？太平洋生物科学公司（PACBIO）支持这种单分子实时（SMRT）测序，我想与您分享有关这项技术的一些想法。

关于单分子实时测序的“ SMRT”是什么？

这是一个很好的问题！好吧，它确实可以实时生成序列，就像纳米孔测序一样。但是，“ SMRT”技术的执行方式略有不同。

首先，这是一种“合成测序”类型的反应，其中包含与不同颜色共轭的核苷酸（A，C，T，G）。等待…现在听起来像Sanger测序反应。然而，在Sanger测序中，双脱氧核苷酸实际上终止了核苷酸链的延长。使用SMRT技术不会发生这种情况。

这项技术的妙处在于，每个SMRT流通池内部都有成千上万个称为零模波导（ZMW）的细孔。每个ZMW代表一个反应室，位于反应室底部的（固定）DNA聚合酶装置。孔径（直径约70nm，深度约100nm）太小，光线无法轻易通过，因此产生的照明观察体积足够小，只能观察到一个核苷酸被掺入，并添加了每个碱基。另外，在掺入核苷酸后，荧光标签被切除。因此，每次将不同的核苷酸掺入亲本模板中时，就可以检测到不同的颜色。因此，SMRT技术和机器就像一台巨型显微镜一样工作，可以实时“看到” DNA合成！

唯一的不足是，需要使用SMRTBell技术将模板DNA预制成哑铃结构的实体。该结构是封闭且圆形的，可确保长时间连续读取。但是你不用担心！您可以在PACBIO购买许多样品和模板准备套件，以加快处理速度。

2 第二代NGS对 第3代NGS

因此，到目前为止，您可能想知道PACBIO SMRT技术与Illumina NGS技术相比如何？尽管两者都是“合成测序”平台，但SMRT技术的一大优势是实时采集信号，这意味着每次添加核苷酸之间都不会出现延迟。这意味着SMRT机器必须配备超灵敏的高速相机/传感器来捕捉颜色变化，因为DNA聚合酶能够以大约1000bp / sec的速度穿过模板！在分子高速公路上谈论快速的法拉利。这就是为什么PACBIO SMRT平台被认为是当前NGS平台中更高级的第三代产品。

那么还有什么其他优点呢？

好吧，测序反应读数的长度已大大延长。与使用Illumina平台的200-300bp的典型读码相比，PACBIO的技术平均可达到20kb的长度，具体取决于核苷酸的化学性质和机器。这是一个很大的改进，因为它可以让科学家破译包含多个重复序列的困难区域，并提供出色的基因组构建图。

此外，另一个很酷的功能是SMRT系统可以根据光脉冲产生的动力学变化来区分某些常见的DNA修饰，例如甲基化。这真是太聪明了！

缺点

PACBIO SMRT系统看上去很棒，但并非没有缺点。主要问题之一是与Illumina平台相比，流通池的通量不那么高。问题在于，并非所有ZMW都能成功完成测序反应。有些孔根本没有DNA模板。因此，这是两个巨人之间的争斗。PACBIO读取长，但流通池成功率低，而Illumina读取短，但通量更高。

另一个问题是，与Illumina平台相比，使用PACBIO SMRT产生的测序错误率仍然很高。我相信，随着时间的推移，这种情况会有所改善，但是现在您至少需要进行15次传递（经过15次）才能生成99％的准确数据。因此，这将在很大程度上影响时间和成本。

结论

那么您如何使用这两种技术？一种提供准确性，但读取长度短，而另一种提供较长的读取，但准确性较低。结合起来怎么样？没错，科学家们尝试通过将两个平台结合使用混合测序方法，有时它可以带来两个世界的优势。一方面，您可以使用PacBio平台来快速，长期读取基因组图谱。然后，您可以使用Illumina测序来确认和挑逗遗传细节！

我迫不及待地希望这种SMRT技术变得更加智能！

参考文献

1. SMRT测序。  太平洋生物科学。2016年4月16日访问。
2. SMRT测序的优势。  基因组生物学。2016年4月16日访问。