转录组学分析之基因芯片的预处理

• 数据详细信息介绍

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65168

从网站中下载编号为GSE65168 的数据集，平台是GPL6244【HuGene-1_0-st】,是Affymetrix公司的新一代芯片（WT），所以因此选择oligo包读取CEL数据，进行更进一步的处理。该芯片一共有八个样本（GSM1588481-GSM1588488），用cDNA芯片分析了正常/缺氧条件下VHL阴性786-O RCC细胞系和VHL转染物的RNA表达情况。从处理条件上，可以将样本分为两类（正常/缺氧）；从是否转染VHL，也可以将样本分为两类（转染/未转染VHL）。

• 实验步骤

 

1. 获取CEL数据。

从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65168

网站上下载编号为GSE65168的原始数据集，在这里请注意，请下载.CEL类型的原始数据。

CEL文件应该是Supplementary file里的raw.tar，解压后就是所有样本的CEL文件。CEL文件是提交数据者提交的芯片原始数据，是Affmetrix公司的芯片格式，需要用专业软件如R打开，不可以被可视化。需要先对CEL文件进行质量控制和数据预处理（具体用bioconductor中对应的不同的包）。

而如果想直接进行分析，如差异基因筛选，可以下载Downloadfamily里的Seires Matrix Files，这是GEO工作人员将提交的原始数据进行整理和标准化后可以被可视化的txt文件，即每个探针的表达量。

下载原始数据压缩包，至本地文件路径（E:\大三下\0-转录组信息学\作业\ GSE65168_RAW）处。

第一步完成。

    2.用R语言从本地路径下提取CEL类型文件。

打开Rstudio。

 

library(oligo)  #加载oligo包

setwd("E:/大三下/0-转录组信息学/GSE65168_RAW")  #设置工作路径

data.dir<-"E:/大三下/0-转录组信息学/GSE65168_RAW" #将CEL存放的路径存放在自定义变量data.dir处

(celfiles<-list.files(data.dir,"\\.gz$")) 

data.raw<-read.celfiles(filenames=file.path(data.dir,celfiles)) #用oligo包中的read.celfiles函数提取CEL文件

data.raw

 

设置探针（样本）的名称。

 

treats<-strsplit("BR HBR VBR VHBR BR HBR VBR VHBR"," ")[[1]]

(snames<-paste(treats,rep(1:2,c(4,4)),sep=" "))

sampleNames(data.raw)<-snames

pData(data.raw)$index<-treats

sampleNames(data.raw)

[1] "BR 1"   "HBR 1"  "VBR 1"  "VHBR 1" "BR 2"   "HBR 2"  "VBR 2"  "VHBR 2"

 

表达矩阵

 

exprs_matrix<-data.raw@assayData$exprs

exprs_matrix[1:5,1:5]

 

   3. 绘制MA图，查看各芯片中Ｍ，Ａ之间的关系。

ＭＡ图可以很好的反映Ｍ和Ａ两个变量之间的关系。

par(mfrow=c(2,2))

MAplot(data.raw[,1:4],pair=F)

MAplot(data.raw[,5:8],pair=F)

 

 

4. 运用oligo包的fitProbeLevelModel()函数，进行数据的预处理。

 

fit<-fitProbeLevelModel(data.raw)

 

#1) background subtraction

#2) normalization

#3) summarization

 

fitProbeLevelModel函数实现了芯片数据预处理的所有过程。

可视化fitProbeLevelModel结果

rle<-RLE(fit,type = "values")

boxplot(rle,col=rainbow(8),ylim=c(-1.2,1.2),main="RLE",ylab="RLE"，cex.axis=0.7)

 

#各样本的众数在0 附近

nuse<-NUSE(fit,type = "values")

boxplot(nuse,col=rainbow(8),ylim=c(0.93,1.07),main="NUSE",ylab="NUSE",cex.axis=0.78)

 

#各样本的众数在1 附近

 

可见对芯片的预处理效果良好，芯片质量可靠。