使用featureCounts进行定量分析

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featuresCounts软件用于统计基因/转录本上mapping的reads数，也就是用于raw count定量。该软件不仅支持基因/转录本的定量，也支持exon, gene bodies, genomic bins, chromsomal locations等区间的定量。

官网如下

http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/

featureCounts集成在subreads 软件中, 类似 word 和 office 的关系, subreads 这个软件也有对应的 R包Rsubreads。

featureCounts 需要两个输入文件：

1. 比对产生的BAM/ SAM文件

2. 区间注释文件

对于区间文件而言，支持以下两种格式

1. GTF 格式

2. SAF 格式

GTF格式在之前的文章中详细介绍过，这里看下SAF格式，示例如下

GeneID    Chr    Start    End    Strand
497097    chr1    3204563    3207049    -
497097    chr1    3411783    3411982    -
497097    chr1    3660633    3661579    -

就是\t分隔的5列文件，记录了基因的染色体上的区间和正负链信息。

在featureCounts 软件中，有两个核心概念：

1. feature

2. metafeature

feature指的是基因组区间的最小单位，比如exon; 而metafeature可以看做是许多的feature构成的区间，比如属于同一个gene的外显子的组合。

在定量的时候，支持对单个feature 定量(对外显子定量), 也支持对meta-feature 进行定量(对基因进行定量)。

当reads 比对到2个或者以上的features 时，默认情况下，featureCounts在统计时会忽略到这部分reads, 如果你想要统计上这部分reads, 可以添加-O 参数，此时一条reads 比对到多个feature， 每个feature 定量时，都会加1，对于meta-features 来说，如果比对到多个features 属于同一个 meta-features(比如一条reads比对到了exon, 但这些exon 属于同一个gene), 则对于这个gene 而言，只会计数1次。

总之，不管对于feature 还是meta-feature, 只有比对多个不同的区间时，才会分别计数。

features 支持对单个样本定量，还支持对多个样本进行归一化。单个样本定量的用法如下

featureCounts 
-T 5  \ 
-t exon \ 
-g gene_id \
-a annotation.gtf \
-o counts.txt \
mapping.sam

多个样本归一化的用法如下

featureCounts \
-t exon \
-g gene_id \
-a annotation.gtf \
-o counts.txt \
 library1.bam library2.bam library3.bam

-a参数指定的区间注释文件，默认是gtf格式;-T参数指定线程数，默认是1;-t参数指定想要统计的feature的名称,取值范围是gtf 文件中的第3列的值，默认是exon;-g参数  指定想要统计的meta-feature的名称，取值范围参考gtf第9列注释信息，gtf的第9列为key=value的格式，-g参数可能的取值就是所有的key, 默认值是gene_id。

输出的表达量文件内容示意如下

# Program:featureCounts v1.6.0; Command:"./featureCounts" "-T" "20" "-t" "exon" "-g" "gene_id" "-a" "hg19.gtf" "-o" "gene" "accepted_hits.bam"
Geneid Chr Start End Strand Length accepted_hits.bam
DDX11L1 chr1;chr1;chr1 11874;12613;13221 12227;12721;14409 +;+;+ 1652 0

#号开头的注释行,记录了运行的命令；Geneid开头的行是表头，Geneid代表统计的meta-features的名称，Chr,Start,End对应染色体上的位置，Strand代表正负链，由于一个基因有多个外显子构成，所以这里的染色体位置信息有多个，和外显子个数一一对应。

Length 该区间的长度，最后一列的表头是你的输入文件的名称，代表的是这个meta-feature的表达量。

这个软件最大的特点就是运行速度非常快，几分钟就可以运行完一个样本的定量。

·end·

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