口腔菌群的差异化输入塑造了与健康状况相关的两种肺型
Differential oral microbial input determines two microbiota pneumo-types associated with health status
Article，2022-8-28，Advanced Science, [IF 17.521]
DOI：https://doi.org/10.1002/advs.202203115
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202203115
主要完成单位：中山大学
通讯作者：丁涛（中山大学）、田国宝（中山大学）
第一作者：张京香（中山大学）、吴一平（中山大学）、刘晶（中山大学附属第五医院）、杨永强（中山大学）
- 摘要 -
口腔和上呼吸道与下呼吸道及肺部有着密切的联系，同时人们也逐渐认识到口腔和上呼吸道微生物群落对肺部菌群的影响。然而，由于缺乏足够样本量的对照分析，口腔和上呼吸道微生物塑造肺菌群的生态过程和个体异质性仍不清楚。在这里，我们分析了唾液、鼻腔、口咽和支气管肺泡灌洗液样本的微生物群落，并测算了多源头微生物对肺部菌群的塑造过程。我们发现口腔和鼻腔微生物通过占据不同的生态位共同塑造了肺部菌群。我们还观察到口腔微生物向肺部的扩散是存在个体间差异的，更多的口腔微生物进入肺部与肺功能下降和促炎细胞因子增加有关。这些结果描述了肺部菌群的外部塑造过程，并提示了唾液等口腔样本在临床环境中监测和评估肺微生物群状态的巨大价值。
- 引言 -
肺部曾经被认为是一个无菌环境，但近年来，宏基因组学研究证实了健康个体的肺部存在共生细菌。这种存在可能与训练宿主免疫力有关，尤其是呼吸系统，但它们的起源仍是有争议的。肺或下呼吸道与上呼吸道和口腔相连，多项研究报道鼻腔和口腔中的微生物参与了肺部菌群的形成。然而，由于缺乏定量的生态知识和对个体差异的解释，这一过程仍不清楚。
近年来，口腔和肠道微生物群的相互作用获得了相当大的关注。据报道，口腔微生物组的破坏是肠炎、关节炎和红斑狼疮的危险因素。有趣的是，在结直肠癌患者的肠道中发现了口腔分类群的累积，例如具核梭杆菌（Fusobacteriumnucleatum）。丁等人发现口腔和肠道微生物群的组成不具有可比性，但微生物群落类型（community type）在不同地点之间是相互可预测的（Ding et al. Nature, 2014）。关于口腔菌群和肺部菌群之间的联系，Robert Dickson等人发现，在口腔中很常见的细菌如普雷沃氏菌属（Prevotella）、链球菌属（Streptococcus）、韦荣氏菌属（Veillonella）和奈瑟氏球菌属（Neisseria）等，在健康个体的肺部也占优势。此外，Leopoldo N Segal 等人观察到，口腔细菌在肺部的富集与 Th17 细胞增殖、肺部炎症通路的上调和肺癌患者的预后不良有关。
用于研究肺微生物群的主要采样方法包括痰样本、支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗液 （BAL）和支气管活检。虽然这些方法可以推断或直接测量肺微生物群的组成，但它们容易受到污染和并且生物量低。因此，肺微生物群落的表征仍然具有挑战性。尽管近年来肺微生物群研究取得了长足的进步，但它仍然在很大程度上受到技术困难的限制，包括从患者身上收集侵入性 BAL 标本以及从低生物量样本中分离、培养和测序微生物。鉴于口腔和呼吸道之间的联系和生物量交换，唾液等口腔标本可能为肺微生物群分析提供高度优化的解决方案。然而，为了评估这种方法的合理性，我们必须评估口腔和上呼吸道微生物群变异性对肺部菌群异质性的影响程度。
为了回答上述问题，并系统研究口腔和鼻腔等上游来源对肺微生物群形成的作用，我们招募了 67 名肺癌患者和 32 名健康志愿者，并收集了他们的唾液、鼻拭子、口咽拭子和 BAL样本。我们将宏基因组测序和细胞因子分析与详细的临床信息相结合，以分析口腔和肺微生物群的系统关联。我们发现口腔微生物对肺部的大部分主要分类群都有贡献，但这些贡献是高度异质的。这种个体异质性塑造了独特的口腔和肺部微生物组，其特征与宿主肺部健康密切相关。
- 结果 -
口腔和鼻腔微生物通过占据不同的生态位共同塑造肺部微生物群
Oral and nasal microbes contribute to the lung microbiome by occupying different ecological niches
我们基于16s rRNA 基因测序数据分析了BAL、鼻腔、唾液和口咽拭子样本的微生物组成，结果表明 BAL、唾液和口咽的微生物群组成与鼻腔的微生物群组成明显分开（图1a）。BAL 样本中最丰富的属包括链球菌属（Streptococcus）、奈瑟菌属（Neisseria）、普雷沃氏菌属（Prevotella）和嗜血杆菌属（Haemophilus）（图1b），并在普雷沃氏菌属、链球菌属和奈瑟氏球菌属中检测到大量潜在病原菌（图1b）。
通过中性模型来衡量上呼吸道和口腔微生物组对肺微生物组组装的相对贡献。中性模型的拟合优度 (R2)值在唾液中为0.7334，口咽为0.714，鼻腔为-0.0987（图1c）。在唾液-BAL 的中性模型中，我们观察到 BAL 中检出频率最高的细菌（Prevotella7、Neisseria、Streptococcus、Veillonella、Haemophilus等）符合中性模型，这表明肺中的优势细菌主要是由口腔提供（图 1d）。我们结合唾液、口咽和鼻拭子微生物群构建了一个多来源中性模型来评估来自不同来源的细菌对肺部菌群组装的贡献（图1e）。与单来源模型的结果相似，口腔和口咽仍然贡献了多源中性模型中的大部分高频细菌，大多数鼻腔贡献物种在肺部的检测频率较低（图 1e）。多来源中性模型的结果表明，口腔和口咽是肺微生物群的主要塑造来源，而鼻腔提供了许多的稀有类群。
图1.各类样本的分类组成及中性模型拟合结果
(a) PCoA结果表明唾液 (n=81)、口咽 (n=87) 和 BAL (n=99) 的群落结构相似，但鼻腔 (n=86) 的群落组成是独特的。(b) ASV的系统发育树，其尖端的形状表示微生物的类型（共生微生物或潜在病原体）。热图的透明度表示微生物的丰度，热图的颜色表示人体的不同部位。条形图显示了身体部位最普遍物种的相对丰度。(c) 以唾液为源的中性模型拟合结果。蓝色实线代表拟合曲线，蓝色虚线代表 95% 置信区间。(d) 三个位点的中性模型中不同拟合结果细菌的相对丰度之和。(e) 多源头中性模型拟合的结果。圆点的颜色代表提供细菌的身体部位。细菌根据它们在肺中的频率（上四分位数和下四分位数）进行分组。表中的数字代表每组中每个身体部位贡献的分类群数量。
口腔细菌输入肺部形成两种肺部菌群类型
Oral bacterial input into the lungs shapes two lung microbiota community types
为了定量测量个体口腔与肺微生物群的交流强度，使用 SourceTracker来计算唾液微生物对肺微生物群的贡献。有趣的是，口腔微生物对肺微生物群的贡献强度遵循双峰分布（图 2a）。为了进一步研究这些差异是如何影响肺微生物群的，我们使用该贡献分数的波谷值作为阈值来定义两种肺型（pneumo-types）并比较它们的差异，并根据口腔细菌对肺微生物群的贡献高低，将两种肺型定义为高口腔输入型（HOIT）和低口腔输入型（LOIT）。为了验证这种分类的合理性和稳健性，我们同时使用Dirichlet 多项式混合模型(DMM)，最后发现两种结果之间是高度一致的（图 2b）。最后，我们比较了配对的唾液和BAL样本之间的距离，发现 HOIT的配对样本距离更为接近（图 2c）。两种肺型间共有18个属存在显著差异（图 2d），一些在 HOIT 中富集的属通常被认为是口腔中的常见物种（例如Prevotella、Neisseria和Veillonella），而在 LOIT 中富集的属（例如 Pseudomonas、Acinetobacter 和 Corynebacterium）在口腔中很少见，但在鼻腔具有很高的的检出率和丰度（图2e）。
图2.肺型的定义和微生物组特征
(a) SourceTracker用于计算唾液对BAL的贡献值，并显示贡献值的核密度图和频率分布直方图，核密度图呈双峰分布。(b) PCoA 结果表面HOIT (n=71) 的BAL样本与LOIT (n=28)的BAL 样本微生物组成存在显著差异。(c)配对的BAL和唾液样本之间的Bray-Curtis距离 (d) ANCOM和LEfSe共同寻找出的两种肺型间的差异菌 (e) 差异微生物热图。
不同肺型间的群落组装和群落功能差异
Community assembly characteristics and microbial function differences of pneumo-types
两种肺型的中性模型结果显示，口腔对肺部菌群的塑造过程均符合中性过程（R2> 0），但 LOIT的扩散系数(m) ( m=0.0126 )（图3b）小于 HOIT（m=0.0418）（图3a），这表明 LOIT 群体对微生物从口腔和上呼吸道向肺部的传播有更多的限制。我们进一步使用归一化随机比（NST）来评估群落组装中随机过程的比例，并观察到HOIT中随机过程的比例更高（图3c）。 HOIT中细菌生态位宽度显着高于LOIT（图3d）。肺中主要口腔来源细菌如Prevotella、Neisseria和Veillonella的生态位宽度在肺型之间存在显着差异（图3e）。这些结果共同反映了肺型之间群落组装的显著不同。我们进一步探索了肺型的微生物表型和功能特征，在HOIT 的肺部微生物组中观察到更高比例的兼性厌氧菌并且合成生物膜的能力更强（图3f）。我们还观察到 HOIT 中富含大量抗生素抗性和毒力基因；大多数抗生素抗性基因是大环内酯类抗性基因（ErmB、ErmF、ErmX 和mel）（图3f）。
图3.肺部菌群的群落组装和微生物功能特征
(a-b) HOIT (n=71)和LOIT (n=28) 的多源中性模型拟合结果。(c)比较肺群落组装过程中随机过程的比例。(d-e) HOIT中生态位宽度最高的前15个分类群在不同肺类型之间的生态位宽度存在显着差异。(f)热图从上到下的模块分别代表临床表型注释、微生物群表型、物种组成、抗性基因和毒力基因。
不同肺型间的肺部和口腔菌群相互作用网络存在显著差异
Significant differences in microbial interaction modes in the oral cavity and lungs between pneumo-types
我们选择了最丰富的菌属并使用SparCC分别为HOIT和LOIT的BAL和唾液微生物群构建生态交互网络（图4a）。我们观察HOIT中BAL和唾液的网络鲁棒性均低于LOIT（图4b）。我们使用 Netshift来比较肺型之间的唾液微生物相互作用网络差异，Prevotella 7、Neisseria、Butyrivibrio和另外 12 个属被确定为关键节点，这意味着这些属促成了两个相互作用网络之间的主要差异，因此被认为是两种肺炎类型之间变化的驱动因素（图4c）。我们选择了具有最高连接度的 Prevotella 7子网络来探索与微生物之间相互作用的变化情况，我们注意到在HOIT中正相关的三对节点（Prevotella 7和Porphyromonas；Prevotella 7和Prevotella；Prevotella 7和Lachnoanaerobaculum）在 LOIT 中都呈负相关（图4d）。
图 4. BAL 与唾液微生物组的相互作用网络及其特征
（a）使用 SparCC 构建了属水平共现网络。这四个区域分别代表不同肺型中BAL (HOIT=71, LOIT=28) 和唾液 (HOIT=59, LOIT=22) 样本的细菌相互作用网络。(b) 四个网络的鲁棒性曲线。(c) Netshift 筛选出网络中存在显着差异的节点。(d) 突出显示唾液样本中的普雷沃氏菌的相互作用网络。
肺型与临床指标和细胞因子水平密切相关
Patients with either pneumo-type are associated with distinct clinical profiles
为了确定肺型是否与宿主健康状况相关，我们调查了队列中的临床概况。我们观察到与LOIT相比，HOIT表现出较差的肺功能（图5a）和更长的住院时间（图5b）。我们还观察到肺型之间 BAL中细胞因子水平的差异，IL-1α、IL-1β、IL-1RA、PDGF.AA 和 RANTES 等促炎因子的水平在 HOIT 中显着升高（图5c）。随后我们分别为每个肺功能指标和细胞因子水平构建了线性回归模型，结果显示肺型对于细胞因子和肺功能以及住院天数都是独立于其他因素的解释变量（图5d,e）。
图5. BAL的细胞因子水平和患者的临床数据
(a)肺型之间的DLCO.SB和DLCO.VA有显着差异（HOIT= 36，LOIT= 16）。(b)HOIT住院天数更长。(c)肺型之间具有显着差异的细胞因子 (HOIT = 61, LOIT = 25)。(d-e)肺功能和细胞因子线性模型拟合结果。
- 讨论 -
本研究具体解析了口腔和上呼吸道微生物群落塑造肺部菌群的过程，重点关注该塑造过程的异质性以及与肺部健康之间的关系。发现高口腔输入型（HOIT）人群的肺功能水平（DLCO）明显更低，促炎因子（IL-1α、IL-1β、PDGF-AA等）水平更高，同时术后住院时间更长。有趣的是，我们观察到口腔和肺微生物群之间变化的一致性，其特点是细菌相互作用网络中的整体协同作用和普雷沃氏菌（Prevotella）为代表的生态位差异。我们还确定了可用于预测肺型的唾液微生物群特征。这些发现使我们能够更好地了解唾液微生物如何影响肺微生物群，并提示了使用口腔微生物作为非侵入性样本替代BAL来评估肺部健康的潜力，为口腔微生物干预来调节肺部微生物乃至呼吸健康提供了理论支持。
参考文献
- 通讯作者简介 -
中山大学中山医学院
丁涛
博导，教授
丁涛，博士，中山大学中山医学院教授，博士生导师。国家高层次引进青年人才，中山大学“百人计划”中青年杰出人才。现为广东精准医学应用会微生态医学分会副主任委员、中国生物物理学会肠道菌群分会委员、粤港澳肠道微生态联盟理事，微生物组学领域国际知名期刊Microbiome和ISME审稿人。现主持和参与包括国自然面上、国家重点研发计划和广东省科技计划项目在内等多项课题。迄今为止以第一作者或通讯作者在Nature、Advanced Science、Microbiome、Microbiology Spectrum、mBio等高水平杂志发表多篇研究论文。
丁涛课题组的研究整合实验手段和生物信息学金属，重点关注1）人体菌群对于健康和疾病的作用及其机制；2）人体菌群的决定机制和组装过程。课题组常年招聘博士后、专职科研人员并招收博士和硕士研究生。欢迎有微生物学、生物信息学、分子生物学、免疫学等相关背景，并且对于科学研究有热情、有想法，有创新精神和团队精神，高度自我激励（highly self-motivated）的青年人才加入团队。
中山大学中山医学院
田国宝
博导，教授
田国宝，博士，中山大学中山医学院教授，博士生导师。国家优青，广东省杰青，中山大学“百人计划”引进人才，热带病防治研究教育部重点实验室副主任、中山医学院免疫学与微生物学系副主任。一直从事临床细菌耐药与感染研究，先后在The Lancet Microbe，The Lancet Infectious Diseases，Molecular Biology and Evolution，Clinical Infectious Diseases等本领域国际顶尖和主流期刊上发表通讯/第一作者SCI论文50余篇，参编专著2部，以第一发明人申请专利11项（授权4项）。主持国自然重点、国际合作、优青、面上、广东省杰青等项目10余项；参与国家传染病重大专项、国家重点研发计划等项目近10项。
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